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2021/3/14 * 吸去旧液 加入消化液 解离细胞约2min 在倒置显微镜下观 察,细胞呈圆粒状 细胞的传代培养:贴附型 PBS洗 涤 1~2次 吹打悬浮细胞 调整细胞密度 分装接种,置于CO2 培养箱中继续培养 在培养瓶中加入 适量含血清培养液 培养细胞 的观察 2021/3/14 * 细胞的传代培养:贴附型 培养细胞 的观察 培养液颜色、是否清亮 培养细胞的状态 2021/3/14 * 细胞的传代培养:贴附型 吸去旧液 加入消化液 解离细胞约5min 在倒置显微镜下观 察,细胞呈圆粒状 PBS洗 涤 1~2次 吹打悬浮细胞 调整细胞密度 分装接种,置于CO2 培养箱中继续培养 在培养瓶中加入 适量含血清培养液 培养细胞 的观察 胰酶消化数分钟 细胞脱离器壁，呈圆粒状 2021/3/14 * 吸去旧液 加入消化液 解离细胞约2min 在倒置显微镜下观 察,细胞呈圆粒状 细胞的传代培养:贴附型 PBS洗 涤 1~2次 吹打悬浮细胞 调整细胞密度 分装接种,置于CO2 培养箱中继续培养 在培养瓶中加入 适量含血清培养液 培养细胞 的观察 中止消化、吹散细胞 细胞计数,调节密度 2021/3/14 * 细胞的传代培养:悬浮型 直立瓶 去旧液 加新液 分瓶接种 加新液 2021/3/14 * 无菌操作注意事项 无菌操作中的注意事项 ??? 在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁。为此,在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。 2021/3/14 * 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化。 2021/3/14 * 冻存和复苏的原则:慢冻快融 当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶;相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 2021/3/14 * 慢冻程序 标准程序: 当温度在-25 ℃以上时, 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时, 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中 细胞冻存盒 2021/3/14 * 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 2021/3/14 * 细胞冻存方法 1预先配制冻存液,避免因临时配制产热而伤害细胞 配方: 含血清培的完全培养基 5% DMSO 2 取对数生长期细胞,经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) 3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 4 年后，存洁率可达80％以上。 2021/3/14 * 细胞复苏方法 （l）从液氮中取出冷冻管,迅速投入37～38 ℃水浴中,使其融化（1分钟左右）。 （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 2021/3/14 * 细胞计数 血细胞计数器:手工计数细胞 Coulter计数仪:人工计数 2021/3/14 * 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。? 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成,从形态上区别死、活细胞是困难的。 1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点