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改良热硼酸法提取青香蕉果肉总 RNA勺条件优化 香蕉是世界上贸易量很大的水果， 被联合国粮农组织定位为 发展中国家勺第 4 大粮食作物 ［1］ ，也是我国南方勺五大名果之 一，是国内重要勺消费和出口资源。由于香蕉重要勺经济价值， 各国科学家关于香蕉功能基因勺研究成为一个热点。 特别是 2012 年法国科学家领导的国际小组对二倍体香蕉 DH-Paha ng基因组 序列进行了测定 ［2］ ，吸引了更多勺研究人员关注香蕉功能基因 的研究。香蕉组织总RNA勺提纯是进行香蕉功能基因研究的必要 前提，在进行RNA分析、逆转录PCRRT-PCR、cDNA合成、Northern 杂交、cDNA文库构建、功能基因筛选过程中都需要有高质量、 高纯度、完整性好的总 RNA。 目前已有多篇文献报道香蕉组织总 RNA勺提取方法，这些方 法主要是十二烷基硫酸钠（SDS法［3-8］、十六烷基三甲基溴化 铵（CTAB法［9-12］、TRIzol法［13］。这些报道仅研究单一提 取方法或对几种提取方法的提取效果进行比较， 并未对影响香蕉 组织总RNA提取的关键因素进行分析。一旦提取 ？八程中出现RNA 纯度低、质量差的情况则很难分析其原因。因此，有必要了解在 提取过程中影响RNA质量的详细因素，以便有针对性地解决提取 总RNA过程中的问题。 笔者所在课题组在进行香蕉多酚氧化酶基因克隆研究中， 须 从青香蕉果肉中提取总 RNA用于研究。但是青香蕉果肉的硬度、 果胶含量、多酚含量均高于成熟香蕉 ［14-15］，采用RNA提取试 剂盒和相关文献报道的方法，均不能获得合格的 RNA香蕉组织 细胞内的多糖、多酚及色素等次生物质， 在RNA提取过程中很难 去除干净［16］。多糖等杂质的存在不仅会使 RNA勺溶解度降低， 还可以抑制许多工具酶的活性， 且多酚、 色素等物质在提取过程 中很容易被氧化而导致 RNA变性，影响RNA用于进一步的分子操 作，因此， 能否在提取过程中尽可能多地去除这些干扰物质是获 得高质量 RNA勺关键［17-19］。 热硼酸法提取植物组织总 RNA已被多次改良，应用于富含多 酚的不同作物、组织总 RNA勺提取［20-21］。但是目前，未有关 于热硼酸法提取青香蕉果肉组织总 RNA过程中影响其质量的因 素研究。在本研究中，笔者对热硼酸法提取青香蕉果肉总 RNA全 过程中的各种影响因子进行了分析， 拟摸索出一种既快速又高效 地提取青香蕉果肉总 RNA勺方法，以期为深入开展香蕉功能基因 的研究奠定良好的基础， 同时为其他富含多糖、 多酚类植物的总 RNA提取提供借鉴。 1 材料与方法 试验材料 巴西香蕉果实、 花采摘于中国热带农业科学院海口实验站实 验基地（福山实验基地）。将采收的香蕉花、青香蕉、黄香蕉的 果肉、果皮分离后分别用液氮速冻，置于 -70 C冰箱保存。 试验仪器 SuperRT cDNA Kit (CW074)1 ，北京康为世纪生物科技 XX 公司；超微量分光光度计 (Nanodrop 2000),美国Thermo公司； PCR^( Tpersonal 48 )，德国Biometra公司；凝胶成像系统 (G: BOX/EF2 ,美国 Syngene 公司；核酸电泳仪(DYCP-31F , 北京市六一仪器厂。 1.3香蕉果肉总RNA提取条件优化 1.3.1RNA常规提取方法参照 Asif等的方法［12］进行优化。 首先将玻璃器皿、铁勺、研钵等清洗干净，然后用锡箔纸包裹， 于180 C烘烤8 h以上，离心管等塑料制品均用 0.1%焦碳酸二 乙酯(DEPC水浸泡过夜，并于 121C高压灭菌30 min , 60 °C 烘干备用。具体操作如下: (1)提取缓冲液［2% CTAB 100 mmol/L Tris- 硼酸(pH 值 8.0 ) , 1.4 mol/L NaCl, 20 mmol/L EDT(pH值 8.0 ) , 2%PVP-K30］ 用前加入B -巯基乙醇至终浓度为2%将其预热至60 C；( 2) 果肉用液氮速冻后研磨成粉末，每 0.2 g果肉加入1 mL提取缓 冲液，涡旋混匀，于 60 C放置30 min，每隔5?10 min颠倒 混匀 1 次；( 3)将提取液冷却至室温，用等体积的三氯甲烷 - 异戊醇(24 : 1)抽提，混匀，静置分层，室温下于12 000 r/min 离心 5 min ；(4)取上清液，加入等体积的三氯甲烷 -异戊醇 (24 : 1)抽提，混匀，静置分层，室温、 12 000 r/min 离心 5 min；( 5)在上清液中加 10 mol/L LiCl至终浓度为 3 mol/L , -20 C 放置 4 h , 4 C、12 000 r/min 离心 20 min ； (6)小心 倒掉上清，沉淀用 0.5 mL