蛋白表达纯化实验步骤.docxVIP

蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、 取适当相应蛋白高表达得动物组织提total-RN A. 2、 设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当得酶切位点与保护碱基。 3、 RT-PCR, KOD酶扩增获取目得基因c DNA、 4、 双酶切，将cDNA、克隆入PET2 8 / 3 2等表达载体. 5、 转化到DH5G感受态细菌中扩增，提质粒. 6^将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如BI2 1（DE3）、Rosett a garni （D E3）、 BI2 1 codon（DE3）等。 7、 蛋白得诱导表达. ）将表达菌株在3mlLB培养基中摇至OD=0、6左右，加入IPTG,浓度梯度从25 U M 到lm M.37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。 2） S DS电泳检测目得蛋白得表达.注：目得蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白得50%以上，在胶上可以瞧到明显得粗大得条带。 3） 将有表达得菌株10%甘油保种，保存lml左右就足够了，并记录I PTG浓度范围。 甘油就是用0、22um过滤除菌得，储存浓度一般就是30%-60%,使用时自己计算用量。 4） 用上述I PTG浓度范围得最低值诱导1 0ml表达菌,18度，低转速（14 0-18 Orpm）, 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1、如果表达得蛋白对菌体有毒性，可以在加1 PTG之前得培养基中加入1%