流式细胞术步骤.docxVIP

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 5 1. 细胞按每孔 4× 10 个的密度接种于 60 细胞培养皿内，培养 过夜后，用相应药物处理细胞。 ( 设置实验组和对照组， 实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ、 5μ、 10μ 辛伐他汀组 正常对照组 ( 组 ) ：胰岛素终浓度 0.058 A 组：辛伐他汀终浓度 2μ 胰岛素终浓度 0.058 ； B 组：辛伐他汀终浓度 5μ 胰岛素终浓度 0.058 ； C组：辛伐他汀终浓度 10μ 胰岛素终浓度 0.058 ； 于 37℃， 52 培养箱中孵育 48h） 胰酶消化收集细胞， 并用 1 缓冲液清洗剩余细胞一次， 全部加入 15 管中。 800 离心 5 分钟，去除上清，加 5 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于 0.5 中。 用低速振荡器边震动边加入 5 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。 次日将固定好的细胞以 1000 的转速离心 5 分钟，弃上清，加 入 4 清洗一次，用 0.4 重悬细胞。 加入 5 μL （10 ） 37℃消化 1 小时，加入终浓度 50 碘化丙 啶（ ）4℃避光染色过夜 （或者 37℃避光染色 1 小时），在 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 细胞按每孔 4× 105 个的密度接种于 60 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 缓冲液清洗剩余细胞一次，全 部加入 15 管中。 3 . 800 离心 5 分钟，去除上清，加 5 缓冲液重悬细胞，再次 离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于 0.1 中，并转移到 1.5 离心管中。 按照 1:100 加入 1 一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育 1-2 小时。 5. 1500 ，小型离心机离心 5 悬细胞，再次离心弃上清，重复  分钟，去除上清，加 1 缓冲液重 3 次，最后将洗好的细胞重悬于 0.1 中。 分别将荧光二抗 488 、 567 按照 1:100 比例加入细胞悬液中，室温孵育 1 小时。 1500 离心 5 分钟，去除上清，加 1 缓冲液重悬细胞，再次 离心弃上清，重复 3 次，最后重悬细胞于 0.2 8. 用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在 分析。  中。 流式细胞仪上 检测 类型细 组  组  组  A 组  B 组  C 组 胞 一抗 无 1 二抗 无 488 488 488 488 488 目的 空 白 对 同型对照 实验组对 实验组 1 实验组 2 实验组 3 照 照 检测 类型细 组 组 组 A 组 B 组 C 组 胞 一抗 无 2a 4 4 4 4 二抗 无 567 567 567 567 567 目的 空白对同型对照 实验组对 实验组 1 实验组 2 实验组 3 照 照 （因为 和 4 同样为鼠源抗体，并且分开进行检测，二抗颜色可 进行调试。尽可能选择效果好的同一种二抗。 可能使用一绿一红，也可能使用两个同样颜色的二抗）