liu5单克隆抗体介绍.pptVIP

2021/3/27 * ③ 转化 加入新配置的病毒液（含10%胎牛血清的RPMI- 1640培养液与病毒过滤液1:1混合）,调整细 胞浓度107个细胞/ml,温浴2-3h,弃上清,加入 含20%血清的RPMI-1640培养液,接种于96孔板 中,每孔接种量0.1-0.5个细胞/ml,每3-5d换 液一次。约一周左右即可见到转化的细胞。 ④ 传代、冻存、监测 一些淋巴母细胞也能释放病毒,当这些淋巴母细胞与淋巴细胞共养时,也能诱导出分泌抗体的转化细胞。 2021/3/27 * ⑤实际操作中影响EBV对细胞转化的影响因素及注意 事项: 支原体污染,导致转化效率低 血清中抗体阳性者体内存在对病毒特异性记忆细胞,机体会 产生对EBV的免疫反应,特别是细胞免疫反应,因此应采用 抗体阴性个体的B淋巴细胞或将T细胞除去。 转化后,细胞明显增殖时应及时传代,并检测上清免疫球蛋 白和抗体分泌情况。 EBV转化B细胞克隆效率低,提高克隆成功率十分困难。转化 细胞抗体分泌能力不稳定。 2021/3/27 * （2）细胞工程单克隆抗体技术 ①人鼠杂交瘤单克隆抗体 基本方法与鼠-鼠杂交相同。 Nowinski(1980)报道在体外用流感病毒致敏人 脾细胞,再与NS-1(小鼠骨髓瘤细胞)细胞融合, 成功地得到了针对Forssman抗原 (嗜异性抗原 )的人单克隆抗体。 人-鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性很不稳定。可 能是由于人染色体丢失或信号传递缺乏相关。 2021/3/27 * ② 人-人杂交瘤单克隆抗体 人-人杂交瘤单克隆抗体核型稳定 但可供利用的人类骨髓瘤细胞种类非常有限。 加上人B淋巴母细胞系和淋巴瘤细胞共有三十 几株。目前实验室仍较多使用由EBV转化的B 细胞筛选出来的淋巴母细胞系。 人类骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞种类很少,实际 应用中,融合率低,形成的杂交瘤分泌抗体 少,远不及制备鼠单抗的融合亲本骨髓瘤细 胞相比。 2021/3/27 * ③EBV转化-融合技术 EBV转化后的B淋巴细胞与鼠源骨髓瘤细胞融合,产生一系列人鼠杂家瘤细胞系（series of human-mousehybridyzation,SHM）。此种杂交瘤生长快,含较多人抗体,抗体分泌稳定。 2021/3/27 * ④ 转基因动物制备抗体 将改造过的人的抗体基因导入小鼠胚胎,以得到在 免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。 这种改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位 的轻、重链各三个互补决定区（complementariy- determining region ,CDR）是鼠源性的,其余部 分均是人源性的。 转人球蛋白基因小鼠的构建为人单抗制备过程解决体 内致敏受限问题提供了一条新的途径。 2021/3/27 * ⑤ 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体 将人免疫干细胞移植到SCID小鼠（染色体突变,使 T、B淋巴细胞功能障碍导致联合免疫缺陷）体内,使其获得人的免疫系统。这种小鼠可以用任何抗原免疫,从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞,进一步进行细胞融合或制备抗体库。 2021/3/27 * （三）基因工程单克隆抗体技术 利用细胞工程制备人单克隆抗体,由于缺乏合适的融合亲本细胞系、不能用任意抗原免疫人体并随意从人体中分离淋巴细胞、杂交瘤融合频率低、抗体分泌稳定性差等限制因素。而鼠源性抗体应用又有其固有的局限性。于是人们试图用基因工程抗体技术制备人源性单抗。 2021/3/27 * （一）免疫球蛋白的结构 （二）免疫球蛋白的生物学活性 2021/3/27 * Amino terminal end Carboxy terminal end Variable regions Constant regions Fab fratgments Fc fragment （一）免疫球蛋白的结构 2021/3/27 * 抗体结构为Y形,一个抗体分子由两个相同的轻链分子（L）（约210个氨基酸残基）与两个相同的重链分子（H）组成（约450个氨基酸残基）。轻链有κ和λ两种,重链有μ、δ、γ、ε和α五种。 整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在给定的物种中,不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。 抗体“Y”的两臂末端约110个氨基酸序列的变化很大,称为可变区。可变区重链和轻链各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度变化,称为高变区(HVR)或互补决定区(CDR),分别为CDRl、CDR2和