生物化学实验十、十一 DNA的琼脂糖电泳检测与紫外分光定量.pptx

DNA的琼脂糖电泳检测与紫外分光定量;完整度检测—— DNA的琼脂糖电泳检测 纯度和浓度检测——DNA紫外检测 ;一、实验目的 二、实验原理及方法 三、实验器材 四、实验步骤 ; 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作;1、琼脂糖电泳特点 2、琼脂糖结构 3、电泳工作原理 4、 DNA迁移速率的决定因素 5、琼脂糖胶浓度选择 6、常见电泳试剂介绍; 琼脂糖核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段 优点：1.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 2.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 3.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 4.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 5.有热可逆性 ;琼脂糖的基本结构是由 1,3 连结的 β-D- 半乳糖和 1,4 连结的 3,6- 脱水 α-L- 半乳糖相间联结而成。琼脂糖在水中一般加热到 90℃ 以上溶解，温度下降到 35 -40℃ 液体形成良好的半固体状的凝胶。 ; 核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；在中性或偏碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 ;DNA分子量的大小：小片段DNA比大片段DNA在其他条件相同下泳动速率要快 琼脂糖凝胶的浓度：琼脂糖浓度越低，相同核酸分子迁移越快 DNA的分子构象：同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状 电压 电泳缓冲液的离子强度 ;DNA分子迁移速率与其相对分子量常用对数成反比; ;2. 5 琼脂糖胶浓度选择 根据样品DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度;（1）荧光染料的介绍：溴化乙锭、 SYBR Green （2）电泳缓冲液 （3）载样缓冲液;（1）荧光染料的介绍;优点： 低毒 不贵 不需要紫外光照 不会产生环境问题;（2）、电泳缓冲液：TAE TAE缓冲液成分:TRIS碱、冰醋酸、EDTA pH8.0～8.2 一般配置成50倍母液，用时稀释 （3）、载样缓冲液(Loading Buffer) 包括甘油,溴酚蓝,SDS等: 甘油:增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 溴酚蓝:作为电泳指示剂，可预测核酸电泳的速度和位置 SDS:用于一些核酸结合蛋白的变性解离。 ;三??? 实验器材;琼脂糖凝胶电泳的设备;四、实验步骤;琼脂糖?;（2）煮胶;;2、配置跑胶缓冲液，放入胶体;3 上样 电泳;每8组 共用一块胶，DNA样每组上一个。DNA Marker一块胶上两个。 120V电泳30min，电源接通后观察正负是否接反（负极的气泡显著多于正极）。 控制电压最高不超过5V/cm（按两极间距离计算出总电压） 。;4.观察和拍照;λ/HindIII DNA Marker;第二部分 分光光度计测DNA浓度、纯度;掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的原理。 ; DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。波长为260n时DNA 或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 ;标准样品:浓度为1μg / ml时，DNA钠盐OD260= 0.02 当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度37μg / ml ,RNA浓度约为40μg / ml ,寡核苷酸浓度约为30μg / ml（底物不同有差异） DNA 浓度测定计算公式：A260×稀释倍数×50＝ μg/ml 注：紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。 ; 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280（280nm是蛋白质的吸收峰）和OD230（230nm是酚类等杂质的吸收峰），计算其比值来衡量样品的纯度。 OD260/OD280的比值用于估计核酸的度, OD260/OD230估计去盐的程度。; 经验值：纯DNA：OD260/OD280 ≈ 1.8 (＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：其OD260 /OD280≈2.0，1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）;实验材料：所提基因组DNA 实验仪器：Quawell 微量紫外分光光度计Q5000 实验试剂：灭菌超纯水 实验耗材：移液器、枪头;1.吸取2μl蒸馏水，清洗上样