生物化学实验十三 PCR扩增鱼类线粒体细胞色素B片段.pptx

鱼类线粒体细胞色素b（Cyt b）基因扩增;掌握PCR的原理和操作方法 体外扩增鱼类线粒体DNA细胞色素b( Cyt b）基因 ;1、PCR 的基本原理 2、PCR基本步骤 3、PCR反应五要素 ;试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 ;2、PCR的基本步骤;PCR的基本步骤;3、PCR反应五要素; 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 ;目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100μl时）； 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 ; dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系： dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 ; 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一； 0.1～2ug 传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本； ;Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响; 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜; Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 ; Cyt b基因是线粒体DNA上唯一的结构和功能被了解得较为清楚的蛋白质编码基因其进化速度较快,适合种群水平差异的检测而且容易为保守序列扩增,在鱼类系统进化和分类研究上有较强的适用性 ;实验材??： 鱼类基因组DNA 实验仪器：PCR仪、制冰机、电泳仪、凝胶成像仪 实验试剂： 超纯水、DNTPs、Taq酶、琼脂糖、DL2000 ladder、10×PCR Buffer、 引物：P1：5’-GCTCAGACTTTAACCGAGACCAAT-3’ 引物：P2:5’-CAACACCGATGCTTTTATGCTAAG-3’ ;1、在0.2ml灭菌离心管中按照表中顺序加入各种试剂 ;注意：1、每4个同学1组，每组同学在0.2ml离心管中配好除DNA模板的体系，分装4个小管，然后每位同学再加入自己的模板 2、微量液体要看清是否吸入枪头 3、避免直接用手接触试剂或者PCR官内侧，防止污染 4、整个过程需要在冰上操作 5、每吸一种溶液换枪头 6 、充分混匀反应体系 2、吹打混匀试剂后，盖好放入PCR仪中 3、设置RCR反应程序：94℃预变性2min，每个循环包括94 ℃变性50s，52 ℃退火50s，72 ℃延伸2min，共30个循环，72 ℃延伸7min。 4、每次反应设立不含DNA模块的空白对照。 5、1.0%琼脂糖跑胶，DL2000 ladder 作为DNA Mark。 ; DNA Ladder 2000