代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱仓势追治龇椒ㄑ芯-精品文档.docxVIP

代谢组学血浆样品前处理及其快速高分辨液相色谱 仓势追治龇椒ㄑ芯 i=r 代谢组学是研究生物体内源性代谢物的整体及其变化规律 的科学[1?4]，作为系统生物学的重要组成部分得到了迅速发 展，并在制药、药物毒理等领域得到了成功应用 [5?9]。人体血 浆作为代谢组学研究中的重要体液样本，其中含有 2000 多种内 源性小分子代谢物 [10] ，与常见的尿液样本相比， 前处理过程相 对复杂。首先，由于含有大量的蛋白质类成分， 因此进行 HPLCMS 分析前需要去除蛋白质；其次，由于血浆中所含成分种类繁多、 极性跨度很大，既有高极性的氨基酸、葡萄糖、核苷类等，也有 低极性的脂类、 固醇类等代谢物。 代谢物成分的复杂性增加了血 浆样品分析的难度与挑战 [11] 。本研究采用快速高分辨液相色谱 仓势琢 ?用技术（ Rapid resolution liquid chromatographymass sp ectrometry, RRLCM）技术，针对血浆样品前处理中常用的有 机溶剂沉淀蛋白法与固相萃取方法进行了比较， 并进行了方法优 化及方法学考察；采用主成分分析（ Principal component analysis, PCA ）对穿插在检测序列中的质量控制（ Quality control, QC ）样品数据进行统计分析，最终建立了适合于代谢 组学研究的血浆样品前处理方法。 2 实验部分 2.1 2.1 仪器与试剂 Agile nt 1200 Series RRLCSystem （德国 Waldbro nn Aglie nt Tech no logies公司）；QTRA PT四极杆？蚕咝岳胱于宕？联质谱 仪（美国 Applied Biosystems/MDS SCIEX 公司），配有 ESI 源 和 Analyst QS1.5 数据处理系统； 乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和 甲酸（色谱纯 , Merck 公司）;标准品分别购自 Fluka 公司、 SigmaAldrich 公司及中国药品生物制品检定所；实验用水为超 纯水。 人血浆样品（EDTA抗凝），采自中国医学科学院北京协和 医院，采集后立即于—80 C冷冻保存。 色谱条件 Zorbax AqC18 色谱柱 （100 mmK 2.1 mmx 1.8 SymbolmAm;美国Agile nt公司）；流动相：A为H2O（含 0.1% formic acid ） ; B 为 CH3CN 线性梯度洗脱：0?20 min , 0?100% B; 20?23 min , 100% R 每次进样前，色谱柱在初始 流动相条件下平衡 8 min ，流速 250 SymbolmA L/min。柱温 60 C；进样量 5 SymbolmA L。 质谱条件 ESI离子源，分别米用正、负离子 EMS扫描模式，喷雾电压 为5500?4500 V 解簇电压（DP）为50?—50 V,源温度375 C, 雾化气为7.5 MPa ,干燥气为6.5 MPa，气帘气为4.0 MPa ,扫 描范围为65?850 Da。数据采集和处理采用 Analyst 1.5 数据 处理系统。 ?-| ?析化学?n ?39卷 ?n ?12期?T?婧等： 代谢组学血浆样品前处理及其快速 高分辨液相色谱 ?仓势追治龇椒ㄑ芯开 ? 标准品及样品的制备 （1）标准品溶液1肌酐（Creatinine , Crea）、L?舶腚装 彼幔?LCysteine，Cys）、L?惨炝涟彼幔？Llsoleucine ，Ile ）、 马尿酸(Hi PP uric acid , HA、葡萄糖(Glucose , Gl )、L? 怖野彼幔?LTyrosine ，Tyr）、犬尿烯酸（Kynurenic acid，KA）、 枸橼酸（Citric acid，CitA ）、胞苷（Cytidine ，Cyt）、次黄 嘌呤(In osi ne , Ino )、亚油酸(Li noleic acid , LA)、甲睾 酮(Methyltestosterone ，MT)、炔诺孕酮(Norgestrel ，Nor)、 氢化可的松（Hydrocortisone ，HyC、胆酸（Cholic acid，ChoA、 烟酸（Nicotinic acid , NA。根据代谢物数据库 hmdb.ca获得 以上 16 种标准品在人体血浆中的正常浓度，按照各化合物在正 常人体中血浆浓度的 100 倍制成 1 mL 的混合标准溶液作为储备 液，用于不同前处理方法比较。（2）标准品溶液2肌酐，L?惨 炝涟彼幔？L?怖野彼幔？犬尿烯酸，氢化可的松，亚油酸（linoleic acid，LA），胆酸，甲睾酮，炔诺孕酮，烟酸，以上10个标准 品按照正常血浆浓度的 100 倍配成混合标准溶液， 用于方法学考 察。（