尿激酶原的研究概况.ppt

尿激酶原的研究概况;一、前言 尿激酶原（Pro-urokinase, Pro-UK）单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(Single-Chain Urokinase-type Plasminogen Activtor)尿型纤溶酶原激活剂(Urinary -type plasminogen activtor );精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”;二、尿激酶原的研究历史;1985 国际血栓形成和止血委员会正式命名尿激 酶原为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂。 1986 欧美开始小规模的临床研究，到1994年以 后开始大规模的临床试验，德国用大肠杆 菌表达的尿激酶原(Saruplase) 先后完成 了6775例心肌梗塞病人的临床试验。 1994 美国Abotte公司研制的尿激酶原(Prolyse) 做了400多例心肌梗塞和脑梗塞病人的临 床试验，现正在做第Ⅲ期临床试验。;三、国内研究概况;五、pro-UK的化学结构 ;尿激酶原的结构; Pro-UK属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有12对二硫键。pro-UK分子按结构功能可分为四个结构域，依次为：（1）表皮生长因子结构域(第5-49位氨基酸残基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促进pro-UK的生物合成有关，该区有三对二硫键，即在11与19、13与31、33与42氨基酸残基之间各有一对二硫键；（2）Kringle（指环）结构域（第50-136位氨基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞膜蛋白结合有关，该区也有三对二硫键，即 50 与130、71与113、102与126氨基酸残基之间各有一对二硫键； ;（3）丝氨酸蛋白酶结构域(144-411位氨基酸残基),位于其羧基端的His204、Asp255与Ser356 三个氨基酸残基构成该酶的活性中心，Asn302 为糖化位点, 该区共有5对二硫键，即在 148-279、189-205、197 -268、293-258和368-380氨基酸残基之间各有一对二硫键；（4）连接区(第136-143位氨基酸残基)。 ;六、pro-UK的理化性质 ;（2） 第二个酶切位点在135和136两个赖氨酸之间，高分子双链UK可被纤溶酶继续水解该酶切位点，并脱去N-末端的第 136位赖氨酸，变成低分子双链UK，分子量为33KD，其活性与高分子UK相同；（3）第三个酶切位点在 143 位谷氨酸与144 位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键产生分子量为32KD的单链低分子尿激酶原(pro-UK)，其溶血栓活性生花特性与高分子pro-UK相似； ;（4）第四个酶切位点在156位的精氨酸与157位的苯丙氨酸之间，凝血酶可水解该位点的肽键，生成双链pro-UK，由148位与279位的二硫键将A、B两条链相连接起来，其活性只有双链UK的1/500，但其催化活性与生化特性与单链pro-UK相似。纤溶酶可水解B链N-端第157和158两个氨基酸，生成双链UK。pro-UK在溶液中不稳定，容易逐渐水解成小分子尿激酶原或变成双链尿激酶，但其冻干品在4℃以下是稳定的。 ;七、尿激酶原的血栓溶解特异性;2、当血栓纤维蛋白暴露出E-片段，单链pro-UK能直接激活结合在该片段C-端两个赖氨酸残基上的纤溶酶原，其活性增加500倍，产生大量纤溶酶，使血栓纤维蛋白迅速溶解，因此pro-UK是特异性的纤溶酶原激活剂。单链pro-UK被纤溶酶、嗜热杆菌金属蛋白酶完全激活后，其比活性与尿激酶相同（1-1.2?105 IU/mg，天然尿激酶或尿激酶原的比活性的国际标准为104,000IU/mg）。 ;尿激酶原作用机理示意图;八、尿激酶原的生产工艺;2、细胞的微载体灌流培养 将工程细胞CL-11G细胞株从生产种子库取出，复苏依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶内培养，基础培养基为DMEM/F12，再转入5升罐培养，细胞密度达到1×107细胞/ml 后转入20L罐培养，采用多孔微载体无血清灌流培养。待细胞密度达到1×107/ml左右时，采用间隙更换部分微载体的工艺，即每隔10～15天更换约1/4微载体，每天收集培养上清