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用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 在弹出的警告上点“是”。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 H：0-30，S：0-255，I：0-230 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 设置好的选色条件也要保存的。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 测量光密度时，要测量灰度图片 彩色图象上象点的强度是由红蓝绿三色混合而成，如果直接在彩色图上测量光密度，会有一个系统误差。所以正规的测量需要把图象中选取的区域外部分涂白，然后转换图象为灰度图片，再测量光密度。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 选择Transparent on White，只显示选择到的区域。再点create preview image复制出一张。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 将复制的图片转换成灰度图片。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 对此图片再作一次选色，这次只需选择一个强度了。I：0-230 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 还要保存一次灰度选色设置。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 3.2.2.4 好啦，点count进行测量。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 看看测量统计数据。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 可以把数据存入excel表格里。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 3.2.2.5别急，还没完事呢。 以上测量的是选择区域内的累积光密度值IOD，但同时测量的面积却未必是正确的面积。 测量数据表里的area是图片上选择的染色区域的面积，这不一定就是我们需要的面积。 我们最终要得到的数据应该是一个平均光密度值，是IOD/area。IOD就是前面测量的IOD SUM.但面积是什么则需要认真选择的。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 在需要测量整张照片染色的时候，面积就是照片面积。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 如果切片只拍摄了一部分，空白处的面积则需扣除。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 很多情况下，是要测量某一组织区域内的光密度。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 可以使用irregular AOI工具来选择测量区域。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 选择一个区域后，点New AOI再选择下一个区域。最后按下图点就行了。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 点了convert to object后马上就能看到测量数据。注意这里只有area值有意义。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄 与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍摄要求。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 显微镜光源 正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清晰度。光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清晰. 不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行。6%的灰度滤光片会导致色彩失真。 如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 固定显微镜的工作条件 不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。 为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 应该使用手动控制曝光的相机 对每张照片要使用相同的曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。 染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 控制相机曝光时间 要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。 把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上调节100%透射。 用ImageProPlus分析免疫组化图片剖析 背景的影响 左图：暗且偏蓝的背景严重降低了黄色的IOD值。而且影响到了阳性区域的色调。 用