10.2总论第II部-遗传变异的创造-第十章-DNA重组2-目的基因的克隆.pdf

111 （续 第十章 DNA重组 1） 2 10-3 基因的克隆 理论上，任何DNA片段的克隆都是可能的。但是，有某种功能 的基因只占细胞核中所含DNA 的极少部分。例如，人类的每个 9 细胞核的DNA量是6 ×10bp，但具有基因功能的部分不超过百 分之几。在从DNA 中取出特定的基因进行克隆的时候，有必要 使用各种各样的DNA操作技术。以下介绍6大类技术。 3 一、基于已知DNA或cDNA序列的PCR扩增克隆 1. 已知全长基因序列的PCR 扩增克隆 这是一种参考已知基因序列的最简单的克隆基因的方法。随着水稻、拟南 芥和各种作物的基因组测序和全长cDNA测序计划的完成与推进，目前在 Genebank 等数据库已有大量的植物基因序列，可根据其基因序列设计特异 引物通过PCR方法克隆不同植物的基因。 4 2. 已知部分基因序列的PCR 扩增克隆 利用表达序列标签(Expressed Sequence Tagging Method， EST)克隆基因是将mRNA在体外反转录成 cDNA后克隆到载体 上，构建cDNA文库；再从cDNA文库中大规模挑选cDNA克隆， 对其3’末端或5’末端进行一步法测序获得表达序列标签。 5 EST序列是一段长150~500bp的基因表达序列片段，是完整基 因上能特异性标记基因的一段序列，通常包含了基因足够的结 构信息。利用EST 或多个EST 序列组装的基因与公共数据库 的基因进行比对，并利用生物信息学方法进行功能预测，可筛 。 选所需的EST序列进行全长基因的克隆 RACE技术是常用的 基于EST序列信息扩增新目的基因全长序列的方法。 6 3. 依据同源序列的PCR 扩增克隆 不同生物的同源基因具有一定的序列同源性，而且亲缘关系越近的基因 序列同源性越高，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。因此在 其他种属的同源基因被克隆的前提下，可选择高度保守区域的DNA序列设 计简并引物，从感兴趣的植物中扩增其同源基因；或以已知的同源基因序 列为探针从构建的cDNA文库或基因组文库中筛选目的基因克隆。 7 多个功能相关基因可以组成一个基因家族，而基因家族内的成 员存在高度保守的同源序列。因此在获得部分家族成员的基因 序列后，可根据家族成员的保守氨基酸序列设计简并引物，并 用简并引物从该生物中扩增该家族的其他成员或其他物种的同 家族成员。 8 如通过对已克隆的抗性基因蛋白序列的分析，发现这些抗病 基因所编码的蛋白都存在同源序列，如富含亮氨酸重复区（ （ （ ，所