园林植物组织培养 (8).pdf

2. 园艺植物cDNA文库构建 真核生物gDNA庞大，复杂程度mRNA的100倍左右，且含 大量重复序列 5 高等生物具10 种不同基因，但在一定时间阶段单细胞或个 体中，只有15%左右基因表达 ，产生约15000种不同 mRNA由mRNA出发的cDNA克隆 2.1 普通cDNA文库构建 1 ）纯化mRNA样品制备  选择特定发育阶段组织为分离mRNA材料  mRNA纯化: 利用3’poly (A)与oligo (dT)互补杂交 ，使 mRNA固定在固相介质上，再将mRNA洗脱-纯化mRNA  mRNA完整性检测 ：据28S和18S rRNA条带亮度判断RNA完 整性间接判断mRNA  28S rRNA亮度是18S 两倍——RNA样品完整  两条带亮度反过来——部分降解  无清晰条带——已经降解 2 ）cDNA第一链合成  关键: 获得大量完整cDNA  影响因素 ：模板mRNA质量、反转录酶、引物  反转录酶 ：禽源 (AMV)和鼠源反转录酶(M-MuLV)  AMV ：DNA聚合酶活性+强RNase H酶活性 M-MuLV ：RNase H活性低 ，反转录效率比AMV低 Superscript反转录酶 ：M-MLV的RNase H ，保证cDNA第一 链的全长和高产  引物 ：常用oligo (dT)和随机六聚体核苷酸 cDNA第一链合成 mRNA G 5‘ppp’5 G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 引物 退火 AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ G 5‘ppp’5 G TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 逆转录酶 dNTP s AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ G 5‘ppp’5 G TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一链 3 ）双链cDNA合成 ① 自身引导合成法  利用新合成单链cDNA 3’末端反转形成的发夹环的双 链部分作引物，以cDNA为模板合成互补第二链cDNA ； 反应结束用S1核酸酶降解发夹环单链部分 ，即可得到双 链的cDNA片段。  缺点:用S1核酸酶去除发夹环时反应条件要求极为苛刻 ， 难以控制， 目前已极少采用 自身引导法合成cDNA第二链的技术流程 ② 置换合成法  用RNase H将杂交双链中mRNA降解，形成多段仍与cDNA第一链保 持杂交的RNA片段  利用这些RNA片段作为引物 ，引导DNA聚合酶I合成第二链cDNA  通过T4 DNA连接酶作用，将各段互补链连接成完整DNA链  利用DNA聚合酶I 5’-3’核酸外切酶与RNase H除去残存的5’端 RNA片段 ，3’-5’核酸外切酶消化cDNA第一链3’端突出的cDNA ， 得到平端双链cDNA片段  目前合成cDNA第二链的常用方法 T4 DNA连接酶 置换合成法合成cDNA第二链 4 ）双链cDNA克隆 cDNA修饰  为提高双链cDNA片段与载体连接效率 ，cDNA需修饰——给平 端双链cD