园林植物组织培养 (10).pdf

三、基因序列同源克隆法  基因序列同源保守性: 不同种植物，行使类似功能的基因，其一级结构可能 相同或极其相似 据此，从一种生物中分离的基因可被用作探针 ，筛选 另一生物cDNA文库或基因组文库 ，来分离与之相应的同 源基因 • 根据已知基因的序列设计并合成引物 • 提取DNA进行PCR扩增 • 扩增片段经纯化后连接到合适的载体上 • 测序并与已知基因序列进行比较 例 ：根据甜菜碱醛脱氢酶基因序列克隆菠菜碱醛脱氢酶基因 操作方法：电子克隆  借助于计算机 ，利用公布的核酸序列资料，进行序列的 拼接和组装最终获得完整基因序列的技术  类似于cDNA文库的筛选,但更加方便快速 四、基于图谱的基因克隆  图位克隆技术 （染色体步移法 ） 根据目标基因在染色体上位置进行基因克隆 应用: 未知基因的功能信息且表达产物未知时，功能基 因在基因组中有相对稳定的座位 前提: 具有目的基因遗传图谱、物理图谱 ，及含有大片 段的染色体DNA文库  基本策略 ： 基因定位 －紧密连锁分子标记为起点－染色体步行－逐 步向目的基因靠近 －最终克隆出目的基因－功能分析验证  基本原理 ：目的基因分子标记初步定位 （RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，利用NIL、BSA法等 ） ↓ 精细定位 ↓ 构建目的基因区域大尺度物理图谱 ，鉴定出包含目的基因的 一较小基因组片段 （PFGE ，YAC1Mb、BAC 100-300kb、TAC克隆， 染色体步移跳跃等策略） ↓ 筛选与鉴定候选基因克隆 （精细作图证实与目标性状共分离；证实其表达与性状表现同；与现有已 知功能基因序列同源比较；转化）  适用于 ：较小的基因组 因为染色体步行时，拟南芥 1cM约290kb ；而小麦1cM约3500kb 重复序列应较少 有高密度分子标记连锁图与物理图 较成熟的转化系统 Martin （1993 ）成功克隆番茄PTO基因 五、基因标签法  将一段已知外源DNA作标签，插入染色体上目的基因  插入使目的基因表达受影响 （激活或失活），产生可筛选的突 变表型，再确定突变表型与所插标签连锁 （遗传分析）  用标签作探针,杂交此突变体基因组文库，克隆与标签相连 的目的DNA （或反向PCR法）  钓出此DNA片段，最终获得与突变相应完整目的基因 5.1 T －DNA标签法 T-DNA: 农杆菌Ti或Ri质粒中,可转移且整合到植物核染色体上 技术路线：T-DNA插入突变 （基因显性 ）— 获得突变体,遗传分 析连锁关系—分离与T-DNA相连的DNA （反向PCR或到突变体基因 文库筛选 ）—以此DNA为探针筛选野生型基因组文库 ，获得与突变 相关的完整克隆—证实 （转化-回复突变？） 应用: 成功分离拟南芥CH-42、LD （开花时间）、EMB30 （胚发 育）、CTR1 （乙烯信号传导）等 5.2 转座子标签法 玉米AC ／DS 转座子可在烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、 矮牵牛等异种植物中转座 玉米、金鱼草、矮牵牛、大豆等生物中基因 ： A1、BZ2 （花色素合成）、VP1 （种子发育）、TS2 （花雌雄 性 ），FLO （花芽分化）、FIM （花形态建成）、玉米核恢复基因 Rf2等