园林植物组织培养 (12).pdf

2. 农杆菌Ti质粒的改造及载体构建 2.1 野生型Ti质粒缺陷 植物基因工程天然载体 但野生型Ti质粒作为基因工程载体存在障碍 ： 1 ）质粒过大（160-240 kb ），操作困难 2 ）RE切点太多，难以找到可利用的单一切割位点的内切酶 3 ）T-DNA区编码基因tms、tmr产物属植物激素类，会干扰受体 植物内源激素平衡而诱发肿瘤 ，阻碍转化细胞的分化和再生 4 ）Ti质粒无选择标记基因 5 ）Ti质粒不能在大肠杆菌中复制 2.2 Ti质粒改造 保留T-DNA两端末端序列(LB,RB 25nt) ，用外源DNA插入或直接 取代野生型T-DNA部分基因，使转化的细胞不成瘤 A. 切除T-DNA onc基因，构建所谓 “卸甲载体”（disarmed vector ） B. 引入大肠杆菌的复制起点和选择标记基因 C. 插入人工多克隆位点 D. 引入植物基因的启动子和poly （A ）信号序列 E. 除去Ti质粒上的其它非必需序列 2.3 Ti质粒中间表达载体 A. 中间载体(intermediate vector) 在E.coli克隆载体(如pBR322质粒)中插入一段合适的T-DNA片 段(便于以后同源重组)而构成的小型质粒（仍为细菌质粒，无转 化植物细胞功能） B. 类型 克隆载体 复制和扩增基因 表达载体 在受体细胞中表达外源基因 C. 主要结构区 选择标记基因区域和目的基因区域 每个区域由启动子、基因和终止序列组成 D. 启动子及调控序列 组成型表达CaMV 35S ；组织特异性或诱导型 E. 嵌合基因的构建 ：特异性P+ 目的基因+终止子； 特异性P+选择标记基因/报告基因+终止子 将嵌合基因插入中间载体，即构建成完整的中间表达载体 2.4 Ti共整合转化载体的构建  中间载体仍是一种细菌质粒 ，不具备把基因转化到植物细胞功能 将其引入到已改造的Ti质粒 ，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体 这种转化是由两种以上的质粒共同构成的，因此称为载体系统 共整合载体系统 双元载体系统 共整合载体(co-integrated vector) 中间载体与改造后的Ti质粒间，通过同源重组产生的一种复合型载体 Ti共整合载体特点 a. 由两个质粒同源重组形成：E.coli质粒中间载体+卸甲Ti质粒同源重组 b. 农杆菌中两个质粒形成一个大的共整合载体 （同源重组成共合体） c. 共合体形成频率与两个质粒重组频率有关，相对较低 转化菌株（工程菌）制备 ： 将外源基因装载到小质粒 把此E.coli小质粒导入农杆菌 利用Ti质粒与小质粒的同源重组，将外源基因引入T-DNA 制成一元载体转化菌株 多克隆位点 目的基因 大肠杆菌质粒 重组质粒 农杆菌筛选标记 大肠杆菌筛选标记 转化 农杆菌 大肠杆菌 细菌接合 T-DNA区同源整合 共整合转化 程序： 农杆菌 感染植物根部细胞 T-DNA区整合在植物细胞基因组上 2.5 Ti双元转化载体的构建 双元载体(binary vector)系统： 由2个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统 构建原理：  Ti质粒Vir基因与T-