园林植物组织培养 (3).pdf

第四节植物基因工程基本技术  核酸分离技术  核酸电泳技术  核酸体外扩增技术 （PCR ）  分子杂交技术 一、核酸分离技术 （一）DNA的分离 （十六烷基三甲基溴化铵） 1. 分离原理 十二烷基磺酸钠  在破碎细胞时（液氮中研磨）加入去污剂 （CTAB、SDS ）使核膜破裂、 核蛋白与DNA链分离  加入变性剂（氯仿/异戊醇）使蛋白质变性沉淀，DNA被抽提  加入无水乙醇或异丙醇使DNA沉淀，与液相中多糖等杂质分离  溶解DNA ，加入RNase去除RNA  用乙醇或异丙醇沉淀DNA 2. CTAB法Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide  CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）去污剂裂解细胞，可与核酸形成复合 物，能溶于高盐溶液中，当盐浓度降低时沉淀  离心将CTAB-核酸复合物同蛋白质、多糖类物质分开  用高盐溶液溶解CTAB-核酸复合物，用无水乙醇沉淀核酸，CTAB溶解 于乙醇中  适用于多糖含量高的植物材料 Main steps 3. SDS法  高浓度SDS （十二烷基磺酸钠）在较高温度 （65℃ ）条件下裂 解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸  提高盐浓度，降低温度，使蛋白质及多糖杂质沉淀  离心出去沉淀后，上清夜中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽 提后用乙醇沉淀水相中DNA 4. 如何保持DNA的完整  在液氮冷冻前，植物材料表面水分一定要用滤纸吸干  应在冷冻状态下进行研磨  必须在解冻前加入提取缓冲液  提取时的各种操作均应温和地进行，避免剧烈震荡  转移DNA溶液的枪头要剪去尖部  不可用反复吸打的方法助溶DNA沉淀 （二）RNA分离 1. RNA分离过程中的问题  防止RNA酶的降解 ：RNA酶生物活性十分稳定；细胞内含量丰富；实验 环境广泛存在  解决办法 ：将RNA酶蛋白变性，DEPC （焦炭酸二乙酯）、RNA酶抑制剂  容易与多糖结合 ：影响RNA的质量及产量  解决办法 ：高速离心去除多糖；低pH抑制酚的解离及氧化；用α-巯基乙 醇、PVP来抑制酚类干扰等 2. 总RNA分离  苯酚法 ：利用苯酚协助破碎细胞；酚/氯仿变性蛋白质并反复抽提核酸； 3 mol/L乙酸钠选择沉淀RNA。  异硫氰酸胍法 ：将异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、SDS三者合用，强有力抑 制了RNA降解；用酸酚（pH3 ）进行抽提，既可保证RNA稳定，又可使 DNA与蛋白质一起沉淀。用异丙醇沉淀RNA后，经酚/氯仿再次抽提纯化。 +  氯化锂沉淀法 ：一定的pH下，Li 使RNA发生特异性沉淀，通过多级沉 + 淀可提高RNA的纯净度。沉淀过程较为繁琐，并存在着Li 的污染问题。 3. mRNA分离  原理 ：植物mRNA的3’-端具有Poly A 结构 ，可用oligo dT-纤维素亲和层 析技术来纯化mRNA  吸附 ：总RNA在流经oligo dT-纤维素层析柱时，在高盐缓冲液作用下， mRNA的3’-端Poly A与连接在纤维素柱上的oligo dT-配对，形成氢键，使 mRNA被吸附在柱上；其他RNA从柱中流出  洗脱 ：结合在柱上的mRNA可以用低盐缓冲液或蒸馏水洗柱，使氢键解 离，mRNA从柱上洗脱下来 二、核酸电泳技术 （一）琼脂糖凝胶电泳技术  琼脂糖凝胶 ：琼脂糖能融化成透明溶液，冷却凝固后形成凝胶，凝胶孔 径大小由琼脂糖浓度决定  分辨率 ：分辨片段大小0.2 ～50 kb  泳动速率 ：由DNA 分子大小、琼脂糖浓度、DNA构象和电泳缓冲液的 成分决定  电泳结果检测 ：溴化乙锭（EB ）嵌入到DNA或RNA分子碱基间在紫外 灯下会发出荧光  注意 ：EB为强致癌物质 ，操作时要十分小心，并且用过的染色液要及 时进行妥善处理 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳技术  PAG ：丙烯酰胺单体-Acr在催化剂过硫酸铵和TEMED存在下，产生聚 合反应形成长链 ，加入交联剂N,N’ –二甲基双丙烯