核酸分离与纯化.pptxVIP

1 核酸是分子生物学实验的主要研究对象，许多分子生物学实验的第一步都要进行核酸的提取，如PCR、基因测序及分子克隆等. 提取核酸的种类:真核细胞基因组DNA、质粒DNA、总RNA及mRNA 第1页/共32页 2 提取的核酸样品的完整性和纯度直接 关系到最后实验的结果 鉴定技术 : 分光光度技术:样品定量、纯度鉴定 凝胶电泳技术:样品定量、纯度鉴定 分子量测定 、分离核酸片段 第2页/共32页 3 第一节核酸分离与纯化的基本过程 一、材料与方法 1.材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞 2.方法： 保证核酸一级结构的完整性 原则 排除其他分子的污染，保证样品的纯度 第3页/共32页 4 二、技术路线 1.核酸的释放 破碎细胞，释放核酸 方法：机械法 破坏线性DNA 非机械法 2.核酸的分离与纯化 大分子污染物 污染物 非需要的核酸分子 对后续实验有影响的溶液和试剂 第4页/共32页 5 3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤 浓缩: 沉淀：有机溶剂沉淀法 原理： 洗涤：用70％～75％乙醇去除沉淀中的盐 第5页/共32页 6 4、鉴定与保存 1.）核酸的鉴定 浓度、纯度、完整性 ①浓度鉴定 a 紫外分光光度法 260nm 在标准条件下，1个吸光度单位相当于 50g/ml的双链DNA 38g/ml的单链DNA或RNA 33g/ml的单链寡聚核苷酸 b 荧光光度法 荧光染料：溴化乙锭 发出橙红色荧光 第6页/共32页 7 ②纯度鉴定 a 紫外分光光度法： 测A260／A280的比值判断是否有蛋白质污染 （为什么） A260／A280比值为1.8，纯DNA A260／A280比值为2.0, 纯RNA b 荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核 酸电泳结果判断纯度 第7页/共32页 8 ③完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸电泳结果判断完整性。 2）核酸的保存 ① DNA的保存 pH 影响DNA稳定性 pH7.0~8.0 EDTA 减少二价金属离子 氯仿 防止细菌污染 温度 低温 -70℃ 保存数年 4 ℃保存 第8页/共32页 9 ② RNA的保存 a 0.3mol／L的醋酸钠或双蒸水，-70℃～-80 ℃。若加入RNA酶抑制剂可延长保存时间。 b 将RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 ℃可长期保存。 小量分装保存 第9页/共32页 10 第二节 基因组DNA的分离与纯化 一、分离与纯化的方法 1.酚抽提法: EDTA 裂解缓冲液 SDS 裂解细胞 蛋白酶K RNA酶 pH8.0的Tris饱和酚抽提 醋酸铵、无水乙醇沉淀 70％乙醇洗涤 DNA 第10页/共32页 11 第11页/共32页 12 2.DNA样品的进一步纯化 方法: 透析、层析、电泳、选择性沉淀 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 第12页/共32页 13 二、DNA片段的回收 (一) 原则与要求 1.提高DNA片段的回收率 2.除去回收DNA样品中的污染 (二) 回收方法： 1.DEAE纤维素膜插片电泳法 琼脂糖凝胶 2.电泳洗脱法 3.压碎与浸泡法 聚丙烯酰胺凝胶 第13页/共32页 14 第三节 质粒DNA的提取与