核酸的杂交分子生物学朱学时.pptxVIP

核酸杂交基本类型; 1） DNA杂交—探针为DNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA;主要内容;第一节 核酸杂交的基本原理;1．在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 ;2 变性方式;1．特点 1）增色效应：在260nm紫外吸收值升高。 2）Tm值改变 3）粘度下降、比旋度下降、沉降系数升高。 4）生物活性丧失。;影响Tm值的因素;2. 影响复性的因素 ;3 变性过程;DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线 ;GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3 ;二、核酸的复性;3 核酸复性的阶段;;4．影响复性过程的因素;三。核酸杂交概念：;;影响核酸杂交的因素;4。离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于杂交。离子强度过高过低则不利于杂交。 5。核酸分子：分子越大，越复杂，杂交难度大，杂交也慢。分子越小，易杂交。 ;第二节 核酸探针 ;二、探针种类和选择;基因组DNA探针 ;1. 基因组DNA探针;重组 DNA 导入受体菌; ;;2. cDNA探针（complementary DNA） ;3. RNA探针：检测DNA和mRNA ;2. cDNA探针（complementary DNA） ;3. RNA探针：检测DNA和mRNA ;4. 寡核苷酸探针 ;三、探针设计原则： ;四、探针标记物的选择 ;寡核苷酸探针 ;设计探针的原则;三、探针标记原理;（一）放射性同位素标记物; ;（二）非放射性标记物;图13-9 生物素标记探针检测核酸过程示意图 ;荧光标记物;四、探针放射性同位素标记法 ;2）基本原理;3。新合成的核苷酸链与旧核苷酸链完全相同，不同的是由同位素标记的核苷酸代替了无标记的核苷酸。 DNA聚合酶I 的作用 1）从3-末端催化链的沿长； 2）从5-末端外切酶的活性。;3）方法;2。随机引物法;3）基本原理;4）随机引物法的方法;五、非放射性探针标记;1。光敏生物素标记核酸;2。酶促生物素标记核酸;3。酶标;六、核酸探针检测;2、非放射性探针检测方法;1）类型： a.直接法??b.间接免疫法；c.直接亲和法；d.间接亲和法；e.间接免疫亲和法 2）显色体系： A .AP 显色体系 B .HRP显色体系;3.非放射性探针检测显色体系;2）HRP显色体系：;第三节 核酸分子杂交技术 ;一、液相分子杂交;二、固相分子杂交;固相分子杂交分类;１。滤膜杂交的基本过程;２。固相支持物选择;1、硝酸纤维膜： 是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用。RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上，尤其是在高盐浓度下，其结合能力可使80-100μg/cm2吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上。 优点 杂交信号本底较低。 缺点 ①由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降。②对小分子量的DNA片段（200bp）结合能力不强。③靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移。④易破碎。 ;2、尼龙膜： 对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350-500μg/cm2。对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。不一定通过真空干烤，只需短时间紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱即可与膜上带正电荷的氨基相互交联，从而使结合更加牢固。 优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）。 缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；杂交信号的本底也高。;3、PVDF膜： 与尼龙膜相似，其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容易被封闭。杂交本底低，结实耐用，可多次杂交。;1. Southern 印迹杂交;Southern印迹杂交方法; DNA或RNA ↓ 电泳分离核酸片段