核酸的研究方法.pptxVIP

核酸的研究方法;核酸的分离、提纯和定量测定; 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用 ; 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，细胞破碎后采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。 DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇;制备RNA时，最重要的是使RNase灭活： ①容器用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。然后经过高温处理?? DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性； ②加入强变性剂（如胍盐：可使所有蛋白质变性）使RNase失活； ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin);① 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白 ②用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提：异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂。后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质 ③用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心，蛋白质在最上面，DNA在中间，RNA沉在底部 ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法 ;（三）核酸含量的测定;3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比;细胞或组织中核酸含量测定方法;纯DNA 比值1.8，＜ 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染 ;二、核酸的沉降特性与超速离心;8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10 ρ ：未知DNA的密度 ρ0：为标准DNA的密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离 r0：已知DNA到转轴的距离;G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系，因此可用能用该方法计算DNA碱基成分，计算公式为： ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（ρ-1.658）× 10 需注意的是： 含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值，不能用该公式计算。;RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大;（四）用于核酸的制备;是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。;电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子 （4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行） 琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭（0.5μg/mL）染色，用紫外光检测;★琼脂糖电泳用于DNA分子量的测定;用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析时不会分解样品。;（一）DNA的酶法测定;末端终止法——Sanger 2’，3’双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。;DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP;（二）DNA的化学法测序：由Maxam和Gilbert所发明。其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱 ;4组特异的反应如下： （1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂 （2）G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂 （3）T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基 （4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂;（三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个： （1）用酶特异切断RNA链： 胰RNase A：嘧啶核苷酸键 米曲霉RNase T1：鸟苷酸核苷酸