CoIP原理及方法计划.docxVIP

精品文档 精品文档 PAGE PAGE12 精品文档 PAGE 免疫积淀（  Immunoprecipitation,IP  ）原理 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“  proteinA/G  特异性地结合到抗体（免 疫球蛋白）的  FC片段的现象开发出来的方法。当前多用  proteinA/G  预先结合在  argarosebeads  上，使 之与含有抗原的溶液及抗体反响后，  beads  上的  proreinA/G  就能达到吸附抗原的目的。经过低速离心， 能够从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其余抗原分别。 免疫积淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结 果，不单需要高质量的抗体，同时对免疫积淀体系也需要有严格的控制指标。免疫积淀实验从：蛋白样品处 理；抗体-agarosebeads 孵育；抗体-agarosebeads 复 基本实验步骤 (1）收获细胞，加入适量细胞 IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或许 4℃裂解30min， 12,000g  离心  30min  后取上清； (2)取少量裂解液以备  Westernblot  剖析，剩余裂解液将  1μg  相应的抗体和  10-50  μlproteinA/G- beads  加入到细胞裂解液，  4°C迟缓摇摆孵育留宿； (3）免疫积淀反响后，在  4°C  以  3,000g  速度离心  5min  ，将  proteinA/G-beads  离心至管底；将上 清小心吸去，  proteinA/G-beads  用  1ml  裂解缓冲液洗  3－4  次；最后加入  15μl的  2×SDS  加样缓冲液， 开水煮  10分钟； (4）SDS,Westernblotting 或进行质谱剖析。 一、样品办理： 免疫积淀实验成功与否，第一步办理样品特别重点。免疫积淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原 和抗体之间的反响，而样品办理的质量决定了抗原抗体反响中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构 象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体 -agarosebeads 孵育对免疫积淀实验是否成功特别关 键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或许 4°达成外，最为重点的是裂解液的成份。 用于免疫积淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或许细胞系裂解液。我们以常用的 RIPA裂解液为 例（主要含有 pH7.4 左右的离子缓冲液，靠近生理浓度下的 NaCl，一定比率的去垢剂和甘油以及各类蛋白 酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们怎样针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选 择最正确的裂解液。 a．缓冲液：离子缓冲液常采用 pH7.4的Hepes 或许Tris-Cl。 b．NaCl浓度一般习习用 150mM ，这主假如因为 150mM 靠近生理浓度，不会损坏蛋白质之间的 相互作用。但是细胞内部的 NaCl浓度并不是均一的，局部 NaCl的浓度能够低到 50mM ，150mM 的 NaCl有可能会损坏这个地区的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最正确的 NaCl浓度要视所剖析的蛋白的亚 细胞定位而定。 c．甘油由于其粘性，能够对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般增添 10%的甘油有 助于稳定蛋白质之间的相互作用。 ．裂解液中的去垢剂能够裂解细胞质膜，也同时损坏了很多细胞器的膜，进而释放了其中储藏的很多蛋白酶。而由于用于免疫积淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大多数得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中，主要由于其抑制蛋白或许其活性抑制环境受到改变后进而恢复了蛋白酶活性。因此，添 加蛋白酶抑制剂关于防备目的蛋白的降解进而达成免疫积淀实验特别重点。一般主要经过增添 EDTA抑制金 属蛋白酶，经过 ProteaseCocktail （多种蛋白酶抑制剂混淆物）能够抑制蛋白酶。 ．去垢剂关于免疫积淀实验尤其是免疫共积淀实验是一个特别重点的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要经过影响以下三个因素来影响免疫积淀效果： 细胞质/器膜的通透性：因为很多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗体才能与之反响。 膜蛋白的释放：很多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度特别敏感，因此针对这类蛋白的免疫积淀实 验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。 蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不同样，需要根据详细蛋白的特性进行剖析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精确预测，所以一个更为确实可行的办法就是经过详细实验筛选合适的去垢剂种