肉毒梭菌及其毒素检验.pptVIP

（1）肉毒毒素检出试验：小白鼠腹腔注射法为标准方法。 0.5mL样品上清液和胰酶激活处理液/只－－各注射小白鼠3只－－ 24h内发病、死亡 主要证状：竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸早呈箱式，腰 部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。 小鼠猝死：以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释， 重做试验。 观察4d 观察4d /full/4054ae8f3bad71a45872a313bc2e9cd7.jpg 学习文档 /gallery2/main.php/d/747-1/botulinum.png （2）确证试验：取致死样上清液分成三份 上清液＋等量多型抗毒素血清－混匀－37℃，30min －－ 0.5mL接种小鼠 上清液＋等量明胶磷酸盐缓冲液－混匀－煮沸10－20min －－0.5mL接种小鼠 上清液+等量明胶磷酸盐缓冲液-混匀－－0.5mL接种小鼠--死亡 上述结果： 可判定检样中存在的毒素是肉毒毒素 必要时要进行毒力测定及定型试验。 存活 学习文档 （3）毒力测定： 稀释判定的上清液： 50 倍－－注射小白鼠各两只/ 0.5mL/只 500 倍－－注射小白鼠各两只/ 0.5mL/只 5000倍－－注射小白鼠各两只/ 0.5mL/只 例：计算检样所注射5000倍稀释液的动物全部存活， 500倍的动物全部死亡，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1 000MLD／mL－10000MLD／mL。 MLD：最小致死量或最小致死浓度(minimum lethal dose MLC) 系指药物/毒物在最低剂量组的一群实验动物中引起个别动物死亡的剂量和浓度 观察4d--死亡存活情况判定毒力 学习文档 （4）定型试验 检样上清液＋等量A抗血清 检样上清液＋等量B抗血清 检样上清液＋等量C抗血清 检样上清液＋等量D抗血清 检样上清液＋等量E抗血清 检样上清液＋等量F抗血清 检样上清液＋等量G抗血清 检样上清液+明胶磷酸盐缓冲液 混匀，37℃作用 30min，各注射小 鼠两只，0.5mL/只，观察4d,观察结果。 能保护动物免于发 病、死亡的诊断血 清型即为检样所含 肉毒毒素的型别。 检样上清液:用明胶磷酸盐缓冲液适当稀释检样的离心上清液 学习文档 注解 ①未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验； ②为争取时间尽快得出结果，毒素检测的4项试验也可同时进行； ③根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型； ④进行确证及定型等中和试验时，检样的稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。 ⑤试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴性结果时，应保留充分的观察时间。 / topic/mus-musculus 学习文档 2）肉毒梭菌检出(增菌产毒培养试验) 取庖肉培养基三支，煮沸10min一15min，做如下处理： a) 第一支：急速冷却，接种检样均质液1ml一2ml； 目的：检测繁殖菌体； b) 第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温 10min，急速冷却 目的：芽孢发芽 c) 第三支：接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。 目的：抑制其他杂菌 学习文档 肉毒梭菌在庖肉培养基中生长： 培养基中含有葡萄糖和碎肉块等，A、B型肉毒梭菌生长旺盛而且产大量气体，表面浑浊，底有粉状或颗粒状沉淀，消化肉块使其变黑有臭味。 以上接种物于30℃厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。 培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同前，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。 学习文档 3）分离培养－菌体鉴定，需要时做 卵黄琼脂平板： 取毒素检测阳性的前述增菌产毒培养物接种卵黄琼脂平板， 35℃厌氧培养48h。 肉毒梭菌菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍 珠层样)薄层，是鉴别该菌较好的方法，但G型菌无此现象。 是因为肉