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实验七 用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测 定蛋白质的分子量 东北大学生命科学与健康学院 一、目的 ? 掌握 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量的原理 ; ? ? 学会安装和使用垂直板型凝胶电泳装置 ; 应用垂直型、 SDS 不连续系统凝胶电泳法、测定蛋白 质的分子量。 二、原理 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS) 是一种基于蛋 白质在电场驱动下，具有不同的移动能力进而对其进行分离的技术，与 蛋白质多肽链的长度或分子量相关。 影响带电粒子电泳的内在因素有三 点：分子所带净电荷、分子量大小和分子的形状。 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) ，是一种很强的阴离 子表面活性剂， SDS 以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢 固的带负电荷的 SDS- 蛋白质复合物； SDS 和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为 1.4 ∶ 1 ，这种高密 度结合，远远超过了蛋白质原有的净电荷，从而消除了由于蛋白质所带 净电荷的不同而对电泳迁移率产生的影响。 二、原理 由于 SDS- 蛋白质的复合物具有均一的电荷密度和荷质比，目前认为， SDS- 蛋白质复合物具有扁平，紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴是恒 定的，数量级在 18? 左右，与蛋白质的种类无关，棒的长轴是变化的，而 长轴的变化正比于蛋白质的分子量，因此 SDS 和蛋白质结合后所形成 SDS- 蛋白质复合物，消除了由于天然蛋白质形状的不同而对电泳迁移率 的影响。 由于 SDS 和蛋白质的结合，消除了分子自身净电荷及分子形状两个因 素的影响，使其电泳迁移率在外界条件固定的情况下，仅取决于蛋白质 分子量的大小，因而可通过与已知分子量的蛋白质分子迁移率进行比较， 求出未知蛋白质的分子量。 二、原理 常用的凝胶 SDS系统由浓缩凝胶和分离胶构成，浓缩胶其丙烯 酰胺浓度为 4-5% ，分离胶浓度为 8%-15% ，浓缩胶的目的是让样品在浓 缩层和分离层的界面压缩到一个超薄的区域（ 1-100nm ），然后在进入分 离胶对蛋白进行分离。 压缩原理：由于浓缩胶 pH 是 6.8 较低，甘氨酸在这里呈两性离子状态 存在，所以这一层的离子强度较低，因此电阻较高，进而形成高电场力， 使蛋白质的在堆集层的迁移速率高于分离层。同时由于浓缩胶孔径大， 对一般蛋白质的迁移速率不造成影响； 因此当蛋白质到达堆积层和分离 层边界时，分离层孔径小，首先到达边界的蛋白质速率便减慢，而后来 的蛋白质仍然保持高速率迁移，便使得蛋白质在边界处堆积浓缩。 三、实验材料、仪器、试剂 实验材料：蛋白质 仪器： 1 、垂直板电泳槽一套 2 、稳流稳压电泳仪 3 、移液器 4 、水浴锅 5 、 烧杯 试剂 （ 1 ）丙烯酰胺 (Acr) 凝胶贮液： 22.2g Acr ， 0.6g 甲叉双丙烯酰胺，加水 溶解并定容到 100mL ，过滤后避光保存， 4 o C 下可贮藏 1-2 个月。 （ 2 ） 10% 的 SDS 溶液 （ 3 ） 10% 的过硫酸铵溶液 （ 4 ）四甲基乙二胺 (TEMED) 溶液 （ 5 ）分离胶缓冲液： 1.5mol/L pH8.8 的 Tris- 盐酸缓冲液，将 18.15g Tris 用水溶解后，用 6mol/L 的盐酸调至 pH8.8 定容到 100mL 。 （ 6 ）浓缩胶缓冲液： 0.5mol/L pH6.8 的 Tris- 盐酸缓冲液，将 6g Tris 溶解 后，用 6mol/L 的盐酸调至 pH6.8 ，然后定容到 100mL 。 试剂 （ 7 ）电极缓冲液：将 6g Tris ， 28.8g 甘氨酸和 1g SDS 加水溶解后，定 容到 1000mL ， pH 应为 8.3 。 （ 8 ）样品缓冲液 (2x) ：将 1g SDS ， 2mL β - 硫基乙醇， 5mL 甘油， 1.0 mL 0.1% 溴酚兰和 1mL 试剂 6 ，用水溶解并稀释到 50 mL 。 （ 9 ） 0.1% 溴酚兰溶液 （ 10 ）已知分子量的标准蛋白（ marker) （ 11 ）未知分子量的蛋白质样品 （ 12 ）考马斯亮兰染色液，称取 0.25g 考马斯亮兰 R250 加入 45mL 甲醇， 10mL 冰醋酸和 45mL 水。 （ 13 ）脱色液： 37.5mL 冰醋酸， 25mL 甲醇加水到 500mL 。 四、实验步骤 1 ．电