第28章基因诊断与基因治疗.pptx

第二十八章 基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy 本章内容提要第一节 基因诊断学基础第二节 遗传病的基因诊断第三节 传染病的基因诊断第四节 肿瘤的基因诊断第五节 基因诊断在法医学上的应用 第六节 基因治疗的概念及策略第一节 基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics一、基因诊断的概念、特点定义： 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing）生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断 （一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。核酸分子杂交流程 待测核酸制备核酸探针制备滤膜上核酸固化探针标记杂交加入标记探针去除未杂交的探针检测杂交信号1. Southern 印迹杂交(Southern blotting) 提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。2. Northern印迹杂交(Northern blotting) RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。3. 斑点杂交（dot blotting） 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。 4. 反向斑点杂交（reverse dot blotting） 先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO） 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。5. 原位分子杂交荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH）挂锁FISH (FISH with padlock) 荧光原位杂交（FISH） 6. 固相夹心杂交法(sandwich hybridization) 待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记的A片段）和检测探针（标记的B片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。固相夹心杂交法示意图 （二） 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR）变性模板引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶延伸退火PCR在基因诊断中的应用RT-PCR荧光定量PCR多重-PCRPCR-ASOPCR-SSCPPCR-RFLP1. RT-PCR2. 荧光定量PCR荧光标记引物 3. 多重PCR 多重PCR示意图A：普通PCR；B：多重PCRASO1ASO2NHMN：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因4. PCR-ASO（三）单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。PCR-SSCP分析原理示意 PCR-SSCP分析 －+纯合突变杂合突变正常人 （四）限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。RLF