动物疾病诊疗技术血清酶学测定2.2.5血清酶学测定.docxVIP

学习资料单 PAGE 1 血清酶学测定 （一）谷一丙转氨酶测定 谷一丙转氨酶(GPT)亦称丙氨酸氨基转移酶(ALT)，是机体的氨基转移酶之一，在氨基酸代谢中起重要作用。GPT广泛分布于动物肝脏、肾脏和心脏等器官中，尤以肝细胞中含量最高，约为血清中的100倍。当肝细胞受损时，细胞膜通透性增加或细胞破裂，肝细胞内GPT大量进入血液导致血液中GPT含量增加。只要有1%肝细胞坏死，血清中的GPT便增加1倍，故血清GPT增加是反映肝细胞损害的最敏感指标之一，具有很高的灵敏度和较高的特异性。GPT是犬、猫和灵长类动物肝脏的特异性酶，测定该酶的活性对于诊断其肝脏疾病有重要意义，而对其他动物肝脏疾病价值不大。下面介绍赖氏比色法测定血清中GPT活性。 【原理】 以丙氨酸和a-酮戊二酸为基质，经谷一丙转氨酶催化作用，产生一定量的丙酮酸，加入Imol酸后酶反应终止，2，4一二硝墓苯肼与丙酮酸作用生成丙酮酸2，4一二硝基苯腙，在碱性条件下呈棕红色，根据色泽深浅推算酶活力。虽基质中a-酮戊二酸也可与2，4~二硝基苯肼反应生产苯腙，但在500～520nm波长下，丙酮酸2，4一二硝基苯腙的显色强度约为d一酮戊二酸2，4~二硝基苯腙的3倍，且a-酮戊二酸的量也较少，因此，利用该差别可反映丙酮酸的生成量。 【器材与试剂】 1．器材试管、试管架、烧杯、容量瓶、记号笔、移液管、电子天平、水浴箱、离心机、酸度计、分光光度计或自动生化分析仪。 2．试剂 (1)0.Imol／L磷酸氢二钠溶液。称取Na2HP04·2H2017.6g溶解于蒸馏水并定容至1L，4℃保存。 (2)0.lmol／L磷酸二氢钾溶液。称取KH2 P042.72g，溶解于蒸馏水并定容至200mL。 (3)0.Imol／L磷酸缓冲溶液(pH7.4)。将0.Imol／L磷酸氢二钠溶液420mL和0.Imol／L磷酸二氢钾溶液80mL混匀，4℃保存。 (4)GPT基质缓冲溶液(DL -丙氨酸200mmol／L，a-酮戊二酸2mmol／L)。精确称取DL -丙氨酸1.79g和a-酮戊二酸29. 2mg先溶于0.Imol／L磷酸盐缓冲溶液约50mL中，用Imol／L氢氧化钠溶液(约0.5mol)调节pH至7.4，再加磷酸盐缓冲溶液至lOOmL，置4℃保存，可稳定2周。 基质液中可加入麝香草酚(0.9g/L)防腐，置4℃条件下至少可用一个月，或者分装于安瓿灭菌，室温至少可放置3个月。 (5)Immol／L2，4一二硝基苯肼溶液。称取2，4一二硝基苯肼99mg，溶于ImollL盐酸500mL中，室温保存。 (6)0.4mollL氢氧化钠溶液。氢氧化钠16.Og，溶解于蒸馏水并定容至1L，置塑料试剂瓶中，室温保存。 (7)lOmmol／L丙酮酸标准贮存液。准确称取丙酮酸钠llOmg，溶解于0.05mol／L硫酸并定容至lOOmL。 (8)2mmol／L丙酮酸标准应用液。将丙酮酸标准贮存液用0.05mol／L硫酸做5倍稀释，混匀。 【测定方法】 (1)赖氏比色法测定血清中GPT的操作步骤按表2- 35进行。 表2 - 35赖氏比色法测定血清中GPT的操作步骤 步骤 添加物质 测定管 对照管 1 血清(mL) GPT基质缓冲溶液(37℃水浴预温5min)(mL) 0.1 0.5 0.5 0.5 2 混匀，37℃水浴30min 3 2，4一二硝基苯肼溶液(mL) GPT基质缓冲溶液(mL) 0.5 — 0.5 0.5 4 混匀，37℃水浴20nun 5 0.4mol/L氢氧化钠溶液(mL) 5.0 5.0 6 混匀，室温放置lOmin,蒸馏水调零，505nm波长比色，以测定管吸光度减去对照管吸光度，查标准曲线得GPT活力(kU) GPT标准曲线的绘制见表2—36 表2—36 GPT标准曲线的绘常 步骤 管导 0 1 2 3 4 5 1 相当于酶活性(kU) 0.lmoUL磷酸盐缓冲溶液(mL) 丙酮酸标准应用液(mL) GPT基质缓冲溶液(mL) 2，4一二硝基苯肼溶液(mL) — 0.01 0 0.5 0.5 28 0.10 0.05 0.45 0.5 57 0.10 0.1 0.40 0.5 97 0.10 0.15 0.35 0.5 150 0.10 0.20 0.30 0.5 200 0.10 0.25 0.25 0.5 2 混匀，37℃水浴15min 3 0.4moI／L氢氧化钠溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 4 混匀，室温放置lOmin，505nm波长，蒸馏水调零，读取各管吸光度，以各管吸光度减去“O”管吸光度，所得差值与对应的酶活力单位作图 单位换算：血