第二章基因工程的酶学基础.pptxVIP

第二章 基因工程的酶学基础 主要内容 第一节 限制性内切核酸酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 外切核酸酶 第六节 单链内切核酸酶 第七节 RNA酶 补充：核酶 甲基化酶 第一节 限制性内切核酸酶(Restriction Endonuclease,RE) 一、寄主的限制-修饰系统(R-M, Restriction-modification system) 大肠杆菌B 大肠杆菌K 修饰的phage λ (B) EOP=10-4（限制作用） EOP=10-4（限制作用） EOP=1（修饰作用） 修饰的phage λ (K) 注：EOP=噬菌体的成斑率 第一节 限制性内切核酸酶 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性内切核酸酶（限制酶）的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。 第一节 限制性内切核酸酶 限制酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 1978年，W. Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖。 第一节 限制性内切核酸酶 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶（甲基转移酶）的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制酶的破坏。 第一节 限制性内切核酸酶 第一节 限制性内切核酸酶 寄主控制的限制与修饰的作用：一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。 基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。 例如K12： rk+mk+ 　 rk-mk- （用于转化实验） rk-mk+（用于转化实验） rk+mk-（自杀性表型） 第一节 限制性内切核酸酶 根据限制性内切核酸酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型四类。 二、限制性内切核酸酶的类型 主要特性 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点 多功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割 单一功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 特异切割 双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游24-26bp处 随机性切割 基因工程中广泛使用 注： SAM为S－腺苷甲硫氨酸 REBASE 数据库(http：///) 第一节 限制性内切核酸酶 1. 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 　 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 　　流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品系的第一个字母，如EcoRⅠ。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，用罗马字母表示，如EcoRⅠ，EcoRⅤ。 4. 限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略) 三、限制性内切核酸酶的命名P14 第一节 限制性内切核酸酶 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。 EcoRⅠ Escherichia 属名 Coli 种名 Ry13 株系 编号 第一节 限制性内切核酸酶 (一)识别序列的特异性 识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。 4bp 　 　 HpaⅠ C↓CGG GG C↑C 　　 5bp　　　　AvaⅡ 　 　 G↓GWCC CCWG↑G 　　 6bp　 　　 SmaⅠ　　　 CCC↓GGG GGG↑CCC　　　11bp 　　 Bg1Ⅰ 　 GCCNNNN↓NGGC