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类胡萝卜素测定方法 类胡萝卜素测定方法 PAGE / NUMPAGES 类胡萝卜素测定方法 类胡萝卜素的测定方法（高效液相色谱法） 本方法合用于各种食品中以羟基类胡萝卜素为主的多种类胡萝卜素的测定。 本方法最低检出量为： α-胡萝卜素为 5ng/mL ，β-胡萝卜素为 mL，γ-胡萝卜素为 mL，番茄红 素为 mL，斑蝥黄素为 mL。 方法概要 样品以丙酮 -石油醚（1+1 体积比）混淆溶剂频频萃取使类胡萝卜素与其余成分分别， 在 450nm 波长条件下进行 HPLC剖析检测，经过外标法计算各样类胡萝卜素的含量。 仪器 1）高效液相色谱仪。 2）冷凝回流皂化妆置。 3）旋转蒸发仪。 4）离心计（ 5000r/min ）。 试剂 本方法所使用试剂除特别注明外，均为剖析纯；所用水为重蒸馏水。 （1）丙酮 -石油醚（ 1+1 体积比）混淆溶剂：取同样体积的丙酮、石油醚混匀。 （2） 50% KOH 甲醇 -水溶液：称取 250g 氢氧化钾，用 50mL 适当水溶解后，用甲醇定容至 500mL 容量瓶，备用。 3）无水硫酸钠（ Na-2SO4）。 4）二丁基羟基甲苯（ BHT）。 5）无水乙醇（ C2H5OH）。 6）流动相使用液： 按乙腈 +二氯甲烷 +甲醇（85+10+5）比率正确量取各溶剂， 并充足混匀，经.45 μm微孔膜过滤后使用。 7）类胡萝卜素标样： α-胡萝卜素、 β-胡萝卜素、 γ-胡萝卜素、番茄红素、斑蝥黄素。 8）标准溶液：正确称取α-胡萝卜素、 β-胡萝卜素、 γ-胡萝卜素、番茄红素、斑蝥黄素一 定量，先分别用少许的乙酸乙酯溶解，再用甲醇配制成  60~80ng/L  的标准贮备液（于  -30℃ 冻箱保存），使用时再配成  ~L 的标准使用液。 4. 测定步骤 （1）样品办理： a. 皂化提取法（如牛奶等脂肪含量较高的样品）  ：取  250L 鲜牛奶于  2℃、 5000r/min  冷冻离 心 30min ，取上层油脂于 250mL 皂化瓶中，加入 50mL 乙醇、40mL 50% KOH甲醇溶液、 BHT， 65~75 30min 定容至  25mL 容量瓶中，备用。 b. 直接提取法（如番茄等脂肪含量较低的样品） 小烧杯中，加入 BHT，用丙酮 -石油醚（ 1+1  ：适当新鲜成熟番茄匀浆后称取 5~10mg 体积比）混淆溶剂提取 3 次，归并、采集上层  于 有机相，频频水洗后，用无水硫酸钠脱水，定容至 25mL 容量瓶中，备用。 取上述提取液 20mL 减压蒸干，用 1mL 甲醇溶解，经 μm微孔膜过滤后待测。 （2）色谱分别条件： 色谱柱： μ-Bondapak C18×150mm)。 流动相：乙腈 +二氯甲烷 +甲醇（ 85+10+5）。 流速： min。 检测器波长： 150nm 。 进样量： 20μL。 柱温： 18℃。 （3）样品测定： 正确汲取样品办理液和类胡萝卜标准混淆使用液 10μL注入高效液相色谱仪 进行分别， 以其标准溶液出峰的保存时间定性， 以其峰面积或峰高计算样液中各种胡萝卜素 的含量。 5 种类胡萝卜的标准色谱图见图 2-19，番茄样品色谱图见图 2-20。 结果计算 依据各标准样品的保存时间和峰面积或峰高，分别对样品中各种胡萝卜素进行定性与定量。 正确度与精细度 在不一样食品中进行不一样浓度加标回收实验、 精细度与重复性实验， α-胡萝卜素、 β-胡萝卜素、 γ- 胡 萝 卜 素 、 番 茄 红 素 、 斑 蝥 黄 素 5 种 类 胡 萝 卜 素 的 回 收 率 分 别为：%~%、%~%、%~%、%~%、%~%。相对标准差 （ RSD）分别为： %~%、%~%、%~%、%~%、%~%。其线性有关系数（ r）挨次为 , , , , (n=7)。 说明 1）类胡萝卜素见光、遇氧简单被损坏，因此标样最好随配随用，或配制高浓度贮备液冲 氮低温冻藏， 使用时配制必定低浓度的工作使用液。 样品的整个提取、 剖析过程应在黄色弱光中操作。 （2）在办理大批试样或搁置时间较长时，要加抗氧化剂（ BHT、 BHA）。 3）在频频提取皂化液时会发生乳化现象，有时难以分别。可滴加无水乙醇，以达到分别成效。 4）本方法较合适于羟基类胡萝卜素的剖析测定，对氧合羟基类胡萝卜素的分别、剖析成效较差。