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菌种复苏传代及保存标准程序 菌种复苏传代及保存标准程序 PAGE PAGE9 菌种复苏传代及保存标准程序 PAGE 菌种的复苏传代及保留标准程序 目的：成立菌种的复苏、传代及保留标准程序。 范围：合用于检定用菌种的复苏、传代及保留的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实行负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性比较间或专用超净工作台内 进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌办理。 1.菌种的复苏 1.1冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所供给，为冷冻干燥菌种(0代)。 使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①器具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。②培育基：依据菌种的性质选择适合的液体培育基（营养肉汤培育基或改进马丁培育基）、营养琼脂（或改进马丁琼脂）斜面数支。③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培育基移入工作台。 1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热， 用灭菌滴管汲取 液体培育基少量，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口翻开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟 内。 1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁汲取合用液体培育基少量，加至菌种管底部， 将 冻干菌搅动促进溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培育基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培育基上。 将已接种的液体培育基及琼脂斜面培育基置规定温度下（一般细菌在 30~35℃，真菌在23~28℃）培育24h。 拿出培育物（第1代），认真察看菌苔形态、有无杂菌，必需时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分别 单菌落。 为保证工作用菌株的传代次数不超出 在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液  5代，并减少购置冻干菌种的次数，可（第1代）冷冻保留，并将此冻存菌液 复苏后的第  2代培育物冻存收藏。 准备：①冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液：由液体培育基与冻存保护液按 1：1比率混匀制成。 按操作，将冻干菌复溶后，汲取菌悬液加入到细菌冻存液中， 混匀。 按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。注明菌名、编号及冻存日期等。 置-20℃或-80℃条件下冷冻保留。 制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培育基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后 冻存。 冻存菌悬液的复苏： 准备： ①器具：灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。 ②培育基：依据菌种的特征选择适合的液体培育基（如营养肉汤培育基10ml、硫乙醇酸盐流体培育基12ml或改进马丁培育基10ml等）、琼脂斜面或平板培育基。 ③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 操作： 从低温冰柜中拿出菌种冻存管，室温下搁置使其自然解冻。 将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培育基等移入工作台。 用75%酒精棉球擦抹菌种冻存管外壁，稍干。 点燃酒精灯，在火焰旁翻开菌种冻存管盖，用一支灭菌滴管汲取解冻的菌 悬液，接种至 10ml液体培育基中（生孢梭菌需接种至 12ml硫乙醇酸盐流体培 养基中）。或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培育基上。 将用过的滴管和菌种管投入消毒液内浸泡，接种环在火焰上灼烧。 将上述接种后的培育基在规定温度下培育 （细菌在30~35℃恒温培育18-24 小时，真菌在23~28℃恒温培育24-48小时，黑曲霉*培育5~7天）。 认真察看培育物：如呈典型菌落即可作为平时工作中使用的菌种， 注明菌 名、编号、代次和接种日期后，置 2~8℃冰箱内保留；如发现菌苔形状不典型， 可进行平板分别单菌落。 注意：已解冻的冻存管不行再冻存。 2.菌种的接种、传代 2.1.准备 ①器具：接种环、酒精灯。 ②培育基：营养琼脂或改进马丁琼脂斜面培育基或适合的液体培育基。 培育基应 新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。 ③消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液。 ④菌种：依据2010年版《中国药典》的要求，传代次数（ n）应不超出4代。 将冰箱中拿出的菌种斜面，在室温搁置30分钟，待温度均衡后再移入接种室 内或超净工作台。 点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜 向上， 两试管口平齐凑近火焰旁。 用右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易拔取，再以右手持接种环在火焰上烧红30秒