九流式细胞仪原理及应用CD绝对计数的原理方法和质量控制.ppt

CD4绝对计数的原理、方法和质量控制;HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义;淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。 CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的维持具有枢纽的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。;HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用;HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化;外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案以及评价治疗效果的实验室标准指标。;;CD4+T细胞;判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防;确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价;整理课件;整理课件;虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:- 丙球蛋白缺乏症- 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症)- 严重的联合免疫缺陷;;仪器的选择;非流式细胞技术;Dynabeads技术计数CD4细胞;流式细胞术（flow cytometry, FCM）;●FCM的特点;功能特点 （1）多参数定量分析每一个细胞； 　　（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。 ; ●流式细胞仪内部结构;流体动力学聚焦;;数据处理系统;基本工作原理;非荧光信号;散射光信号区分裂解后的外周血细胞群;荧光测量;自发荧光;数据的显示与分析;单参数直方图 一维参数（荧光或散射光）与颗粒技术（Count）构成，反映同样荧光强度的颗粒数量的多少 横坐标：光信号波长相对值（信道） 纵坐标：被测细胞的相对数量;双参数直方图 点图 二维等高图：等高线连接相同细胞数的点 密度图 假三维等高图;三参数直方图;流式细胞仪的多参数分析;G2 ;双平台法： 单平台法：;流式细胞技术 传统的FCM: 双平台法;传统的FCM: 单平台法;;FACSCaliburTM 系统 选配 BDB Tritest/TruCOUNTTM 试管;;样本制备(Lyse/No-wash 技术); 细胞亚群的细胞获取数 Beads 总量 细胞亚群的;CD4绝对计数结果;整理课件;;仪器性能;仪器性能;检测试剂盒组成（50人份/盒） 荧光试剂 2个组合/人份 CD4PE/CD3PE-CY5 CD8PE/CD3PE-CY5 固定液 效期 2—8 0C储存6个月 ;质控试剂盒（50人份/盒） 零，低，中，高 4种靶值微球 效期 2—8 0C储存1个月 ;使用简单方便;实验报告;自动设定分析区域;CD3 ;设定分析群体;CD3 ;绝对计数公式;举例;CD4;CD4+T细胞检测的质量控制;实验前质量控制 　　①采集标本前病人的准备； 　　②正确的标本采集方法； 　　③准确及时的运送标本； 　　④实验前正确地处理和保存标本。 实验中质量控制 　　①质控品的准备； 　　②试剂的评价选择 ③ 仪器的校准 　　 ④开展Levey-Jennings 质控图质控（或“即刻法”质控）。　 实验后质量控制 　　①实验后准确填写检验结果； 　　②及时发出报告； 　　③正确地解释检验结果的临床意义　 ④文件管理 ;实验前质量控制;实验中质量控制;淋巴细胞免疫分型的质控品;International Program for Quality Assessment ;整理课件;我 国;使用稳定的人血对照作为淋巴细胞免疫分型的内部质量监控;TruCOUNT controls 对整个绝对计数过程的质控，结果超出标准值的时候，提示吸样过程、绝对计数珠、仪器等出现问题。 ;流式细胞术检测的质控图;试剂选择;仪器校准校准;移液器校准;设备维修与校准; 仪器参数可以由FACSComp 和CaliBRITE TM 微球, 仪器调控软件自动设置.;流式细胞术检测的质控图;流式细胞术检测的质控图;实验后质量控制;实验后质量控制;实验后质量控制;实验后质量控制　;CD4T细胞检测文件和文件管理;CD4T细胞检测文件和文件管理;CD4绝对数产生误差的可能性13%(CD4200/ul),19%(CD4200/ul 血球记数仪WBC变异系数(CV)9.3%-17.6).自动记数淋巴细胞CV 1.9%-5.3% 正常样品 CD4+T细胞百