基因工程酶学基础DNA连接酶.ppt

基因工程酶学基础DNA连接酶;第二节 DNA连接酶;2.1 DNA连接酶的发现(P21);在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD＋[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的； 而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。 ;;2.2 DNA连接酶的基本性质;;;2.3 分类（P21）;10×连接缓冲液;;同种内切酶产生的黏性末端的连接 同尾酶产生的黏性末端的连接 不同黏性末端的连接;同种内切酶产生的黏性末端的连接;同尾酶产生的黏性末端的连接;不同黏性末端的连接;平末端的直接连接;平末端的连接;???接用T4DNA连接酶连接平末端;末端修饰后的连接;DNA片段末端同聚物加尾后连接;黏性末端修饰成平末端后再连接;2.5.6 加上连杆后再连接(P133);;; DNA连杆连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的连杆相同的限制位点，这样在酶切消化连杆产生黏性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。 当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的连杆，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。 ;2.5.7 DNA接头(adapter)连接法 (P134);;;;小结：平末端DNA片段的连接;PCR产物的连接（P135）;现象：普通的Taq酶会自动给PCR产物的3’末端添加一个A（3’ -A） ，因此不能直接将PCR产物末端抹平后连接。