免疫组织化学技术.ppt

减少或消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法： * PPT课件 对照： 阳性对照：用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 阴性对照：用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。 * PPT课件 染色 特异性染色 非特异性染色 显色部位 特定细胞或间质 细胞和间质均匀染色或更强 显色定位 特定，具有结构性 无特定部位，无结构性 显色程度 同一部位呈不同程度显色 无分布规律，某一片均匀着色 免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。 阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可显著区别。 * PPT课件 阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性 ③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。 对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计 * PPT课件 淋巴细胞标记物： 白细胞共同抗原（LCA, CD45）：主要分布于T, B细胞， 单核细胞，粒细胞表面。 CD20： B细胞标记物。 CD45RO、CD3：T细胞标记物。 CD57：为自然杀伤细胞的标记物。 CD38：为浆细胞的标记物。 CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。 * PPT课件 PPT课件 PPT课件 组织化学技术 * PPT课件 组织化学的基本概念： 组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法 免疫组织化学：基于抗原抗体反应 酶组织化学 * PPT课件 精品资料 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……” 疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白水平上进行的研究。 免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平表达的研究。 蛋白表达= 分布，定位，定量； 蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等 * PPT课件 材料： 抗体： 多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。 * PPT课件 显示物： 酶标反应： ①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP） AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作用，可形成不同颜色的终产物。用新品红（New fuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。 ②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。 * PPT课件 荧光标记：荧光素标记抗体 异硫氰酸荧光素（Fluorescien isothioyarale, FITC）520－530nm 四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm 四乙基罗达明（Teraethyle rhodamine B200, RB200）590－600nm * PPT课件 胶体金： 指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， 免疫电镜观察 * PPT课件 主要方法： 直接法： 间接法：经过了第二抗体放大效应 * PPT课件 PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。 * PPT课件 ABC法： 生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以适当方式显示。 * PPT课件 S-P法（LSAB）：