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2012-2013 学年第二学期分子生物实验考试题库 1、PCR原理是什么 答： PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。它的特异性 是由两个人工合成的引物序列决定。引物就是与待扩增 DNA 片段两侧互补的寡 核苷酸。双链 DNA 是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链 DNA 分子 （变性），两引物分别与两条 DNA 的两侧序列特异复性，在适宜条件下， DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸，在引物 的引导下，按 5 →3方向复制互补 DNA，即引物的延伸。在适宜的条件下，这种 热变性 →复性 →延伸的过程不断循环重复，前一个循环的产物 DNA 可作为后一 个循环的模板 DNA 参与 DNA 合成，使产物 DNA 的量按 2^n 方式扩增。 2、PCR一般体系应加入哪些试剂 答： 10*PCR缓冲液（含 Mg+）、模板 DNA、四种 dNTP、一对引物、耐热 Taq 聚 合酶。 3、PCR防止其它 DNA 污染，应注意哪些问题 答：标本放置时密封要严避免溢于容器外，容器要清洁避免造成相互间交叉污 染；移液器使用要规范避免污标本间污染 ;无菌工作台操作， 避免气体中有杂菌。 4、影响 PCR产物产量的因素主要有哪些 答：引物、酶的种类及浓度、 dNTP 的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯 化程度、 Mg2+浓度、温度与时间、循环次数。 5、引物设计应注意哪些问题 答：①引物长度不宜过长 20bp 左右较佳；②引物扩增片段的长度以 200-500 为 宜；③引物碱基的中 G+C的含量应在 40-60%为宜， G+C太少则扩增效果不佳， G+C 过多则易出现非特异条带；④避免引物内部出现二级结构，避免两天引物 间互补，特别是 3端的互补否则会形成二聚体结构；⑤引物 3端的碱基，特别 是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR失败。 6、简述克隆某一原核生物基因片段一般操作步骤 答：克隆某一原核生物基因片段是可用 PCR技术对基因进行大量扩增，首先准 备好实验材料大体为：需扩增的模板 DNA、DNA 聚合酶、 dNTP混合液、 PCR缓 冲液、引物等、其过程大体分为 3 个步骤：第一步：变形：通过加热使 DNA 模 板双螺旋链解离为单链，第二步：退火：当温度突然降低时。由于模板 DNA 结 构复杂难再互补，而引物建构简单且数量巨多易于模板 DNA 互补杂交从而使引 物结合到模板上 DNA 上，第三部：延生：在 DNA 聚合酶和四种底物及镁离子存 在条件下 DNA 连开始延伸。以上 3 个步骤为一个循环，数小时后即可得到大量 扩增的目的片段。 7、什么是质粒质粒的基本性质有哪些 答：a 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位， 包括真核生物的细胞器和 细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸 (DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、 酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA 分子。在基因工程中质粒常被用做 基因的载体。 b 具有复制起点。 携带易于筛选的选择标记。具有多种限制性内切 酶的切割位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。 8、