一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 108103159 A (43)申请公布日 2018.06.01 (21)申请号 201611032170.3 (22)申请日 2016.11.22 (71)申请人 天津华大医学检验所有限公司 地址 300000 天津市自贸区（空港经济区） 环河北路80号空港商务园东区3号楼 201-1室 申请人 深圳华大基因股份有限公司　 广州华大基因医学检验所有限公司 (72)发明人 刘磊　宋炎　张乐橦　刘军　 朱红梅　叶明芝　 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 孙银行　彭家恩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) 权利要求书1页 说明书11页 序列表5页 附图2页 (54)发明名称 一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种高特异性的碱基突变多 重PCR检测方法，包括：在无3’-5’外切酶活性且 有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷 酸盐存在的环境下，使用多对修饰引物进行PCR 扩增，修饰引物的上下游引物的3’末端均是双脱 氧核苷酸，该3’末端与待检测突变型模板上下游 序列互补，DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述 修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸， 多对引物特异性结合模板并正常延伸，实现多重 PCR扩增。本发明解决了多重PCR非特异性条带干 扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏 度，增加体系对引物的容量；可针对肿瘤患者或 A 健康人采集的体液DNA进行检测。 9 5 1 3 0 1 8 0 1 N C CN 108103159 A 权　利　要　求　书 1/1页 1.一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：在无3’-5’ 外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用多对 修饰引物进行PCR扩增，所述修饰引物的上下游引物的3’末端均是双脱氧核苷酸，该3’末端 与突变位点上下游的野生型序列互补，所述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物 的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，实现多重PCR扩增，产物包含野生型 与突变型DNA片段。 2.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述修 饰引物是预先合成的3’末端缺少所述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶 和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到所述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。 3.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述模 板DNA是基因组DNA或游离DNA。 4.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述碱 基突变是单碱基替换、插入或缺失，或短序列插入、缺失或拷贝数变异。 5.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方 法用于组织、血浆、癌组织、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞和淋巴液样本的基因检 测。 6.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方 法用于恶性肿瘤相关体细胞突变的基因检测。 7.根据权利要求1所述的高特异性的碱基