一种高特异性的碱基突变PCR检测方法发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 108103157 A (43)申请公布日 2018.06.01 (21)申请号 201611032111.6 (22)申请日 2016.11.22 (71)申请人 天津华大医学检验所有限公司 地址 300000 天津市天津自贸区（空港经济 区）环河北路80号空港商务园东区3号 楼201-1室 申请人 深圳华大基因股份有限公司　 广州华大基因医学检验所有限公司 (72)发明人 张乐橦　宋炎　刘磊　刘军　 朱红梅　叶明芝　 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 孙银行　彭家恩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图4页 (54)发明名称 一种高特异性的碱基突变PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种高特异性的碱基突变PCR 检测方法，包括：首先对模板DNA进行巢式PCR富 集；然后使用无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解 活性的DNA聚合酶，在焦磷酸盐存在的环境下，使 用修饰引物进行PCR扩增，修饰引物在模板上对 应的位置位于巢式PCR引物的内侧，其3’末端是 双脱氧核苷酸，与待检测突变型模板互补而不与 正常野生型模板互补，DNA聚合酶依赖模板而焦 磷酸解修饰引物的3’末端的双脱氧核苷酸，引物 正常延伸，使用实时荧光定量PCR记录扩增曲线， 检测Ct值差异。本发明的方法解决了碱基低频突 变快速检测中存在的非特异性条带干扰和引物 A 二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度。 7 5 1 3 0 1 8 0 1 N C CN 108103157 A 权　利　要　求　书 1/1页 1.一种高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：首先对模板DNA 进行巢式PCR富集；然后使用无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶，在焦磷酸 盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，所述修饰引物在模板上对应的位置位于巢式 PCR引物的内侧，所述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与待检测突变型模板互 补而不与正常野生型模板互补，在有待检测突变型模板存在的情况下，所述DNA聚合酶依赖 模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，使用 实时荧光定量PCR记录扩增曲线，检测Ct值差异。 2.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述修饰引 物是预先合成的3’末端缺少所述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和 ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到所述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。 3.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述模板DNA 是基因组DNA。 4.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述碱基突 变是替换、插入或缺失。 5.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法用 于多种体液样本的基因检测。 6.根据权利要求5所述的高特异性的碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述多种体 液样本包括血浆、癌组织、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞和淋巴液。 7.