汇总——RT-PCR详细步骤.docxVIP

精品word学习资料可编辑 名师归纳总结——欢迎下载 试验一 哺乳动物细胞总 RNA 的提取，电泳（定量） 试验二 反转录 -聚合酶链式反应 （ RT-PCR） 试验三 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 试验一 哺乳动物细胞总 RNA 的提取，电泳 一，试验目的 学习并把握总 RNA 的分别提取，检测质量以及定量的方法；二， 试验原理 细菌的总 RNA 主要由 rRNA ，tRNA 及 mRNA 组成，其中 rRNA 含量最多 （占 80%~85 ％）； 在 pH 6.0 微酸环境下， RNA 相对稳固，碱性环境下，易分解； 验成败的关键；RNA 的产量取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得4~7 μ g RNA ，每 106细胞可获得 5~10 μ g RNA ，提取的RNA A 260 /A 验成败的关键； RNA 的产量取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得 4~7 μ g RNA ，每 106 细胞可获得 5~10 μ g RNA ，提取的 RNA A 260 /A 280 比值一般为 1.8~2.0 ； 在 RNA 相关试验过程中，须树立 RNase-free 思想： 1）样品新奇，储存得当，以强变性剂， 防止内源性 RNase； 2）人体上遍布 RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯； 3）空 气中灰尘和细菌含 RNase，应建立洁净的操作环境； 试验介绍如何使用 TRIzol 来分别总 RNA ； TRIzol 是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂， 和使 RNase 失活的异硫氰酸胍， 它能在破裂和溶解细胞时保持 RNA 的完整性， 防止 RNA 降解； （留意： TRIzol 具有剧烈腐蚀作用，当心操作； ） 三，试验材料，试剂与器材 1，细胞（ 5х 106Hela） 2，DEPC 水溶液， PBS， TAE 3，氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯4，TRIzol 试剂购自 Invitrogen 5，烧杯（ 1000 ， 500， 100， 50ml 如干），量筒（ 1000， 500 ， 250， 50 ， 20 ml 如干），玻璃 棒，药勺，试剂瓶，三角瓶；枪头（ 1000 ，200，20 ul ），离心管 (0.2ml ，0.5ml PCR 管 ,1.5ml ， 2ml ，7ml 离心管 )，枪头盒； 精品word学习资料可编辑 名师归纳总结——欢迎下载 四，试验步骤 RNA 提取前的预备 ，玻璃器皿，金属及耐 250℃物品的处理： 于高温烘箱中干烤， 180 ℃， 5 小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部； ，塑料制品的处理： 0.05-0.1% 的 DEPC （焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜： 必需保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头， 0.2ml ，0.5ml PCR 管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的试验保证特别重要，须当心操作） ； 泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的 DEPC 水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好； 121℃，30 分钟高压灭菌， 以排除残存的 DEPC ，否就 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用； DEPC 是蛋白质强变性剂 ,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性； 具 强挥发性，致癌物 ，因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，当心操作； ，试剂的配制： 试验所用试剂也可用 DEPC 处理过夜， 再高压灭菌 ,但 DEPC 能与胺和巯基反应 ,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理，可用 DEPC 处理的水配制， 并尽可能用未曾开封的试剂， 然后高压灭菌； 所需烧杯等必需干烤处理以后方可用； 0.05-0.1 ‰的 DEPC 水（三蒸水） ，磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜， 121℃， 30 分钟高压灭菌； RNA 的提取 (TRIzol 法)： 安全去除细胞生长介质 往细胞培育瓶中加入 1ml PBS 洗涤单层细胞，不要将细胞破裂，倒出 PBS 洗涤液 向细胞培育瓶中加入 2mlTRIzol ，以枪当心吹打，分入 2 个 1.5mlEP 管中 室温下培育五分钟（使核蛋白复合物充分分别）时间可能更长 30min 精品word学习资料可编辑 名师归纳总结——欢迎下载 向 EP 管中加入 0.2ml 氯仿/1mlTRIzol ，用力摇动 15 秒钟，室温培育三分钟 12000g，4o C 离心 15min 当心吸取上层无色水样层（ 0.6ml/mlTRIzol ）转移至一新 EP 管中 加入 0.5ml/mlTRIzol 异丙醇，室温放置 15min 12000g，4o C