一种新型冠状病毒2019-nCoV体外诊断标准品的制备方法发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 113049817 A (43)申请公布日 2021.06.29 (21)申请号 202110287418.5 (22)申请日 2021.03.17 (71)申请人 杭州启泰生物技术有限公司 地址 311100 浙江省杭州市余杭区康信路 597号8幢 (72)发明人 杨孝丽　李国强　 (74)专利代理机构 杭州仁杰专利代理事务所 (特殊普通合伙) 33297 代理人 张俊 (51)Int.Cl. G01N 33/569 (2006.01) G01N 33/531 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) C07K 16/46 (2006.01) 权利要求书3页 说明书6页 附图1页 (54)发明名称 一种新型冠状病毒2019-nCoV体外诊断标准 品的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种新型冠状病毒2019‑nCoV 体外诊断标准品的制备方法，包括以下步骤：(1) 小鼠免疫；(2)细胞融合；(3)杂交瘤细胞的筛选 及建株；(4)单克隆抗体的制备纯化与性能测试； (5)新型冠状病毒2019‑nCoV体外诊断标准品制 备。本发明提供了一种新型冠状病毒2019‑nCoV 体外诊断标准品的制备方法，单克隆抗体由细胞 株稳定分泌，人IgG/IgM天然提取手段纯熟、已有 体外重组的完整IgG/IgM蛋白，制备方法简单，成 本低，制得的交联物标准品具有免疫检测活性， 不受来源的限制，可作为天然人源标准品的替代 A 品，能够满足大量的使用需求。 7 1 8 9 4 0 3 1 1 N C CN 113049817 A 权　利　要　求　书 1/3页 1.一种新型冠状病毒2019‑nCoV体外诊断标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1)小鼠免疫：以重组抗原2019‑nCoV‑N蛋白免疫5周龄BALB/C小鼠，采用皮下多点免 ^ 疫，采尾静脉血收集血清，待所采尾静脉血的抗血清效价达0.23×106时进行细胞融合； (2)细胞融合：取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0采用PEG法进行融合，得融合细 胞； (3)杂交瘤细胞的筛选及建株：将融合细胞采用有限稀释的方式培养，细胞培养上清检 测，阳性细胞株进行克隆化培养；经3～4次克隆化检测，获得单克隆细胞株，保留高效价且 可持续稳定传代分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株； (4)单克隆抗体的制备纯化与性能测试：经小鼠腹腔诱生腹水，采集腹水经纯化得到纯 化抗体，抗体命名为MXG04‑211；以SDS‑PAGE测试MXG04‑211，纯度95％；间接ELISA测试抗 体活性，捕获抗原为特异性2019‑nCov‑N蛋白，第二抗体为辣根过氧化氢酶标记的山羊抗小 ^ 鼠IgG抗体，MXG04‑211以PBS缓冲液稀释至相应比例，抗体效价达10 5；经特异性分型酶测 试，MXG04‑211为IgG1型抗体； (5)新型冠状病毒2019‑nCoV体外诊断标准品制备：将由MXG04‑211经SPDP进行巯基修 饰得到的(MXG04‑211)‑SH与由IgG经SMCC进行马来酰亚胺修饰得到的IgG‑SMCC进行交联， 得到的交联物MXG04‑211IgG即可作为新型冠状病毒2019‑nCoV体外诊断标准品；或将由 IgM经Traut`s试剂进行巯基化修饰得到