新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用发明专利.docxVIP

新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用 技术领域 本发明涉及基因工程领域，具体涉及新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法 与应用。 背景技术 冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order Nidovirals)、冠状病毒科 (family Coronavirade)、冠状病毒属(genus Coronavirus)的成员，基因组为单股、正链的RNA， 基因组全长在26～32kb之间，是目前已知基因组最大的RNA病毒。人冠状病毒目前已知有 六种，分别是二十世纪60年代发现的人冠状病毒229E(HCoV-229E)和HCoV-OC43，2003年 出现的SARS-CoV，2004年在荷兰分离的HCoV-NL63，2005年在中国香港鉴定的HCoV-HKU1 以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征(Middle Eastrespiratory syndrome virus， MERS)冠状病毒MERS-CoV。冠状病毒能够感染机体的呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以及神 经系统，造成不同程度的病理性损伤，严重者甚至造成死亡。 在SARS-CoV-2冠状病毒的病毒颗粒结构中，S蛋白(spike protein,S protein)是一个十 分重要的靶点。SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白存在融合前构象和融合后构象，其会识别细 胞膜上受体蛋白ACE2(angiotensin converting enzyme 2)，通过宿主细胞的弗林蛋白酶进行切 割，使蛋白分为S1和S2，进而介导并促使病毒包膜与细胞膜发生融合，融合后产生的抗体 多为结合抗体，没有中和作用，使疫苗免疫原性大打折扣。 相关技术中，采用的新型冠状病毒的刺突蛋白S基因(序列号NC_045512.2)作为靶序 列，但该基因在人肾细胞HEK293表达水平很低，通过其制备得到的疫苗可能无效或是效价 很低，不足以抵抗病毒的感染。 因此，开发一种有效且高效的新型冠状病毒疫苗对于新型冠状病毒的防治与控制具有极 为重要的意义。 发明内容 本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种新型 冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗，该疫苗采用人Ad26型腺病毒载体，解决了人体内Ad5预 存抗体水平高的难题，提高了疫苗免疫效果，扩大了适应人群。 本发明的第一个方面，提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体，该Ad26腺病毒载体负 载有新冠病毒Spikes优化序列。 真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不 同的mRNA剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质，这对蛋白的 表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列(新冠病毒Spikes蛋白)进行密码 子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了新冠病毒Spikes蛋白表达的唯 一性，减少了蛋白后续纯化的难度。 本发明通过将密码子优化后，S基因的弗林蛋白酶切位点发生突变(RRAR突变为GSAS)， 同时在S基因的986aa～987aa的KV突变为PP，使S蛋白维持稳定的融合前构象，大大提升 了疫苗的免疫原性。将突变后的S基因整合到复制缺陷型Ad26载体上，通过腺病毒感染细 胞，呈递新冠病毒抗原，免疫后使机体产生特异性免疫反应，从而阻断新冠病毒的感染。 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新冠病毒Spikes优化序列 如SEQ ID NO.1所示。 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Ad26腺病毒载体为复制 缺陷型Ad26腺病毒载体。 在本发明的一些更优选实施方式中，所述复制缺陷型Ad26腺病毒载体为缺失E1和E3 区基因的复制缺陷型Ad26腺病毒载体 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，外源基因启动子选自人巨细胞 病毒CMV启动子、鼠巨细胞病毒CMV启动子、EF1a或PGK1中的至少一种。 在本发明的一些优选实施方式中，外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV启动子或、 鼠巨细胞病毒CMV启动子。 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Ad26腺病毒载体可以调 控SEQ ID NO：1所示核酸序列的表达。 本发明的第二个方面，提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的制备方法，包括如下 步骤： (1)扩增SEQ ID NO.1所示序列，重组构建穿梭质粒1； (2)扩增穿梭质粒1基因组，重组构建穿梭质粒2； (3)扩增穿梭质粒2基因组，重组构建穿梭质粒3； (4)扩增穿梭质粒3基因组，得到目的片段CMV-SPd-BGH，将目的片段CMV-SPd-BGH与去除E1和E3基因的pAd26质粒共转染至细胞中，即得新型冠状病毒Ad26腺病毒载体。 本发