新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法发明专利.docxVIP

新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法 技术领域 本发明属于包含酶、核酸或微生物的测定或检测方法技术领域，具体涉及一种用于小鼠实验的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法。 背景技术 新型冠状病毒COVID-19能够引起人呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。新型冠状病毒COVID-19在全球肆虐，严重危害了人类健康。 目前全球都在加紧开展针对新型冠状病毒COVID-19的疫苗和药物的研发，无论是疫苗制备还是药物研发都离不开动物模型，小鼠模型在传染性疾病研究中具有极为重要的作用。研究表明新型冠状病毒可以感染ACE2转基因小鼠，ACE2转基因小鼠是研究新型冠状病毒COVID-19的一种重要动物模型。目前没有用于检测实验小鼠的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒，因此有必要开发针对检测小鼠组织中的新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒，以满足小鼠实验中定性和定量检测新型冠状病毒COVID-19的需要。 发明内容 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种用于小鼠实验的新型冠状病毒COVID-19实时荧光定量PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法，能够满足小鼠实验中对小鼠各组织的新型冠状病毒COVID-19定性和定量的检测的需求。 本发明的第一方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，包括针对新型冠状病毒COVID-19N基因的特异性引物如SEQ ID NO.1-2所示，及第一探针如SEQ ID NO.3所示。 本发明的第二方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测试剂盒，其包括上述的新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针，还包括检测小鼠内参基因beta actin的特异性引物及内控探针，所述引物如SEQ ID NO.4-5所示，所述内控探针如SEQ ID NO.6所示。 按上述方案，所述试剂盒包括分开包装的PCR反应A液和PCR反应B液； 所述PCR反应A液包括引物对集、探针组、dNTP Mixture和PCR buffer； 所述的引物对集由第一引物对和内标引物对组成，所述的第一引物对包括特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(第一引物对是针对新型冠状病毒COVID-19的N基因设计的检测引物，包括SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物)，所述内标引物对包括特异性引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5(内标引物对是针对小鼠内参基因Beta actin设计的引物，包括SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物)； 所述探针组由第一探针SEQ ID NO.3和内控探针SEQ ID NO.6组成；所述的第一探针是针对第一引物对扩增序列设计的探针，所述内控探针是针对内标引物对扩增序列所设计的探针； 所述PCR反应B液由热启动DNA聚合酶、逆转录酶以及RNA酶抑制剂组成。 进一步地，所述试剂盒还包括： 阳性对照：含新型冠状病毒COVID-19N基因扩增序列质粒以及小鼠内参基因Betaactin扩增序列质粒的混合液； 阴性对照：无核酸酶水(RNase Free Water)。 进一步地，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为含浓度梯度的新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒的多个标准品。阳性标准品一方面可以定量本试剂盒检测的线性范围，另一方面根据阳性标准品的的扩增曲线，计算本试剂盒检测的标准曲线，从而定量出检测样品中新型冠状病毒COVID-19RNA的拷贝数。 作为优选地，所述阳性标准品包括标准品1，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?7拷贝/mL；标准品2，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?6拷贝/mL；标准品3，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?5拷贝/mL；标准品4，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?4拷贝/mL；标准品5，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?3拷贝/mL，标准品6，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?2拷贝/mL；标准品7，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?1拷贝/mL，标准品8，新型冠状病毒COVID-19的N基因扩增序列质粒浓度为1×10?0拷贝/mL。 本发明第三方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测方法，包括：以提取的小鼠组织样本的