基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗发明专利.pdfVIP

基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗 技术领域 本发明属于抗病毒疫苗领域，具体涉及一种基于酵母表面展示系统的 COVID-19 亚单位疫苗。 背景技术 新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称“新冠病毒”)是继SARS-CoV、 MERS-CoV 之 后，在人类大规模爆发的传染性冠状病毒，其能引起新型冠状病毒肺炎 (COVID-19，简称“新冠肺炎”)。 新冠病毒由双层脂质的囊膜组成，包含刺突蛋白(Spike glycoprotein，S)、包 膜蛋白(Envelope protein，E)、膜蛋白(Membrane glycoprotein，M)以及核衣壳蛋 白(Nucleocapsid protein，N)。其中S 蛋白和N 蛋白是其中最重要的靶点蛋白。S 蛋白就是冠状病毒表面的“皇冠”，位于病毒最外层，与病毒的传染能力相关。S 蛋白含有两个功能亚基：分别是S1 和S2，S1 通过与宿主受体结合促进病毒感染， 其中S1 的C 端的受体结合区域(RBD)负责识别受体呼吸道细胞表面的血管紧张素 转换酶ACE2 进入胞内感染人类。S 蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融 合的功能，是宿主中和抗体重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。 亚单位疫苗是目前构建COVID-19 疫苗的主流种类之一，基于 SARS-CoV-2 的 关键蛋白或多肽，利用细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞进行体外表达，是开发 COVID-19 亚单位候选疫苗的主要策略。尽管目前已有十余种COVID-19 亚单位候 选疫苗已进入临床试验，但是疫苗的安全性、关键蛋白的构想稳定性以及免疫应 答水平的保证还仍有待进一步的确认。 而随着COVID-19 的不断蔓延，仍然亟需开发更多的新型COVID-19 候选疫苗 以应对SARS-CoV-2 高突变带来的挑战。 发明内容 本发明要解决的问题是：提供基于酵母表面展示系统的COVID-19 亚单位疫 苗。酿酒酵母表面展示系统利用酿酒酵母的a-凝集素受体在细胞表面显示外来蛋 白。凝集素受体由Aga1(Gene ID:855780)和Aga2(Gene ID:852851) 基因编码的两 个亚单位组成。酿酒酵母能够展示高分子量的蛋白质，能对表达的外源真核生物 蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键，其相比其他展示系统有较多优势。 首先，酿酒酵母具有公认的安全性(GRAS)，并且在食品和医药工业中已经被大量 使用。其次，酿酒酵母EBY100 的细胞壁表面成分中含有佐剂β-1,3-D-葡聚糖和甘 露聚糖，能够增强机体对抗原的免疫应答。再次，酵母分子显示系统具有典型的 真核特异性、翻译后修饰机制，能够表达许多翻译后修饰所需的功能蛋白。再次， 酿酒酵母的培养方法简单，成本低，生长周期短，能够大规模应用于工业生产。 本发明的技术方案如下： 本发明提供了一种重组质粒，它是能够融合表达SARS-CoV-2 抗原基因与凝集 素受体Aga2 亚基，得到融合蛋白的重组质粒；所述SARS-CoV-2 抗原基因为RBD 基因，序列如SEQID NO.1 所示；所述Aga2 亚基以C-末端与RBD 基因融合。 进一步地，上述Aga2 亚基与SARS-CoV-2 抗原基因之间有接头序列，所述接 头序列翻译得到的氨基酸序列为(G 4S) 3，所述(G 4S) 3 为 GGGGSGGGGSGGGGS。 进一步地，上述质粒以pYD1 为骨架质粒，所述pYD1 优选为Invitrogen 生产 的pYD1。 本发明还提供了一种重组酵母，它是包含上述重组质粒的酵母；所述酵母是 S.cerevisiae EBY100。 进一步地，上述酵母与凝集素受体Aga1 亚基连接，所述Aga1 亚基与所述重 组质粒连接；优选地，所述酵母与凝集素受体Aga1 亚基通过β葡聚糖共价连接； 和/或所述Aga1 亚基与所述重组质粒通过二硫键共价连接。 本发明还提供了上述重组酵母在制备COVID-19 疫苗中的用途。 进一步地，上述疫苗为口服疫苗。 本发明还提供了一种COVID-19 亚单位疫苗，它是以上述重组酵母为活性成 分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。 进一步地，上述制剂为口服制剂。 本发明还提供了一种制备权利要求3 或4 所述重组酵母的方法，其包括如下 步骤： (1)构建凝集素受体亚单位Aga2 基因的C 末端与SARS-CoV-2 抗原基因融合的 重组质粒； (2