基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗发明专利.docxVIP

基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗 技术领域 本发明属于抗病毒疫苗领域，具体涉及一种基于酵母表面展示系统的 COVID-19亚单位疫苗。 背景技术 新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称“新冠病毒”)是继SARS-CoV、 MERS-CoV之后，在人类大规模爆发的传染性冠状病毒，其能引起新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称“新冠肺炎”)。 新冠病毒由双层脂质的囊膜组成，包含刺突蛋白(Spike glycoprotein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)、膜蛋白(Membrane glycoprotein，M)以及核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)。其中S蛋白和N蛋白是其中最重要的靶点蛋白。S蛋白就是冠状病毒表面的“皇冠”，位于病毒最外层，与病毒的传染能力相关。S蛋白含有两个功能亚基：分别是S1和S2，S1通过与宿主受体结合促进病毒感染，其中S1的C端的受体结合区域(RBD)负责识别受体呼吸道细胞表面的血管紧张素转换酶ACE2进入胞内感染人类。S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合的功能，是宿主中和抗体重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。 亚单位疫苗是目前构建COVID-19疫苗的主流种类之一，基于 SARS-CoV-2的关键蛋白或多肽，利用细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞进行体外表达，是开发COVID-19亚单位候选疫苗的主要策略。尽管目前已有十余种COVID-19亚单位候选疫苗已进入临床试验，但是疫苗的安全性、关键蛋白的构想稳定性以及免疫应答水平的保证还仍有待进一步的确认。 而随着COVID-19的不断蔓延，仍然亟需开发更多的新型COVID-19候选疫苗以应对SARS-CoV-2高突变带来的挑战。 发明内容 本发明要解决的问题是：提供基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗。酿酒酵母表面展示系统利用酿酒酵母的a-凝集素受体在细胞表面显示外来蛋白。凝集素受体由Aga1(Gene ID:855780)和Aga2(Gene ID:852851) 基因编码的两个亚单位组成。酿酒酵母能够展示高分子量的蛋白质，能对表达的外源真核生物蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键，其相比其他展示系统有较多优势。首先，酿酒酵母具有公认的安全性(GRAS)，并且在食品和医药工业中已经被大量使用。其次，酿酒酵母EBY100的细胞壁表面成分中含有佐剂β-1,3-D-葡聚糖和甘露聚糖，能够增强机体对抗原的免疫应答。再次，酵母分子显示系统具有典型的真核特异性、翻译后修饰机制，能够表达许多翻译后修饰所需的功能蛋白。再次，酿酒酵母的培养方法简单，成本低，生长周期短，能够大规模应用于工业生产。 本发明的技术方案如下： 本发明提供了一种重组质粒，它是能够融合表达SARS-CoV-2抗原基因与凝集素受体Aga2亚基，得到融合蛋白的重组质粒；所述SARS-CoV-2抗原基因为RBD基因，序列如SEQID NO.1所示；所述Aga2亚基以C-末端与RBD基因融合。 进一步地，上述Aga2亚基与SARS-CoV-2抗原基因之间有接头序列，所述接头序列翻译得到的氨基酸序列为(G?4S)?3，所述(G?4S)?3为 GGGGSGGGGSGGGGS。 进一步地，上述质粒以pYD1为骨架质粒，所述pYD1优选为Invitrogen生产的pYD1。 本发明还提供了一种重组酵母，它是包含上述重组质粒的酵母；所述酵母是S.cerevisiae EBY100。 进一步地，上述酵母与凝集素受体Aga1亚基连接，所述Aga1亚基与所述重组质粒连接；优选地，所述酵母与凝集素受体Aga1亚基通过β葡聚糖共价连接；和/或所述Aga1亚基与所述重组质粒通过二硫键共价连接。 本发明还提供了上述重组酵母在制备COVID-19疫苗中的用途。 进一步地，上述疫苗为口服疫苗。 本发明还提供了一种COVID-19亚单位疫苗，它是以上述重组酵母为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。 进一步地，上述制剂为口服制剂。 本发明还提供了一种制备权利要求3或4所述重组酵母的方法，其包括如下步骤： (1)构建凝集素受体亚单位Aga2基因的C末端与SARS-CoV-2抗原基因融合的重组质粒； (2)将重组质粒导入感受态酵母菌中，即可； 所述SARS-CoV-2抗原基因为RBD基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 进一步地，上述步步骤(2)的导入步骤如下： 1)用LiAc制备酵母菌菌悬液，0～10℃作用5～20min，得感受态酵母； 2)ssDNA煮沸5～20min，冷却； 3)将步骤1)得到的感受态酵母、步骤2)处理后的ssDNA、分子量大于 3000的PEG与重组质粒在水中混匀，25～35℃下作用20～24min，4