新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法发明专利.pdfVIP

新型冠状病毒COVID-19荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法 技术领域 本发明属于包含酶、核酸或微生物的测定或检测方法技术领域，具体涉及一 种用于小鼠实验的新型冠状病毒COVID-19 荧光定量PCR 检测引物、探针、试剂 盒及检测方法。 背景技术 新型冠状病毒COVID-19 能够引起人呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸 困难等，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚 至死亡。新型冠状病毒COVID-19 在全球肆虐，严重危害了人类健康。 目前全球都在加紧开展针对新型冠状病毒COVID-19 的疫苗和药物的研发， 无论是疫苗制备还是药物研发都离不开动物模型，小鼠模型在传染性疾病研究中 具有极为重要的作用。研究表明新型冠状病毒可以感染ACE2 转基因小鼠，ACE2 转基因小鼠是研究新型冠状病毒COVID-19 的一种重要动物模型。目前没有用于 检测实验小鼠的新型冠状病毒COVID-19 核酸检测试剂盒，因此有必要开发针对 检测小鼠组织中的新型冠状病毒COVID-19 核酸检测试剂盒，以满足小鼠实验中 定性和定量检测新型冠状病毒COVID-19 的需要。 发明内容 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种用 于小鼠实验的新型冠状病毒COVID-19 实时荧光定量PCR 检测引物、探针、试剂 盒及检测方法，能够满足小鼠实验中对小鼠各组织的新型冠状病毒COVID-19 定 性和定量的检测的需求。 本发明的第一方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19 荧光定量PCR 检测引 物和探针，包括针对新型冠状病毒COVID-19N 基因的特异性引物如SEQ ID NO.1-2 所示，及第一探针如SEQ ID NO.3 所示。 本发明的第二方面提供了一种新型冠状病毒COVID-19 荧光定量PCR 检测试 剂盒，其包括上述的新型冠状病毒COVID-19 荧光定量PCR 检测引物和探针，还 包括检测小鼠内参基因beta actin 的特异性引物及内控探针，所述引物如SEQ ID NO.4-5 所示，所述内控探针如SEQ ID NO.6 所示。 按上述方案，所述试剂盒包括分开包装的PCR 反应A 液和PCR 反应B 液； 所述PCR 反应A 液包括引物对集、探针组、dNTP Mixture 和PCR buffer； 所述的引物对集由第一引物对和内标引物对组成，所述的第一引物对包括特 异性引物SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2(第一引物对是针对新型冠状病毒COVID-19 的N 基因设计的检测引物，包括SEQ ID NO.1 所示的正向引物和如SEQ ID NO.2 所示的反向引物)，所述内标引物对包括特异性引物SEQ ID NO.4 和SEQ ID NO.5(内 标引物对是针对小鼠内参基因Beta actin 设计的引物，包括SEQ ID NO.4 所示的正 向引物和如SEQ ID NO.5 所示的反向引物)； 所述探针组由第一探针SEQ ID NO.3 和内控探针SEQ ID NO.6 组成；所述的第 一探针是针对第一引物对扩增序列设计的探针，所述内控探针是针对内标引物对 扩增序列所设计的探针； 所述PCR 反应B 液由热启动DNA 聚合酶、逆转录酶以及RNA 酶抑制剂组成。 进一步地，所述试剂盒还包括： 阳性对照：含新型冠状病毒COVID-19N 基因扩增序列质粒以及小鼠内参基因 Betaactin 扩增序列质粒的混合液； 阴性对照：无核酸酶水(RNase Free Water)。 进一步地，所述试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为含浓度梯度的 新型冠状病毒COVID-19 的N 基因扩增序列质粒的多个标准品。阳性标准品一方 面可以定量本试剂盒检测的线性范围，另一方面根据阳性标准品的的扩增曲线， 计算本试剂盒检测的标准曲线，从而定量出检测样品中新型冠状病毒 COVID-19RNA 的拷贝数。 作为优选地，所述阳性标准品包括标准品1，新型冠状病毒COVID-19 的N 基因扩增序列质粒浓度为1×10 7 拷贝/mL；标准品2，新型冠状病毒COVID-19 的 N 基因扩增序列质粒浓度为1×10 6 拷贝/mL；标准品3，新型冠状病毒COVID-19 的N 基因扩增序列质粒浓度为1×10 5 拷贝/mL；标准品4，新型冠状病毒COVID-19 的N 基因扩增序列质粒浓度为1×10 4 拷贝/mL；标准品5，新型冠