第4章基因工程的主要技术及其原理.pptxVIP

第四章 基因工程的主要技术及其原理; 提取和纯化DNA，首先需破碎或溶解细胞，用高盐（1mol/L NaCl）将DNP抽提出来，再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。;(2). 与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；;(3). DNA的沉淀与纯化;以稀盐溶液提取DNA，可加入适量SDS使蛋白质变性解聚，使DNA解离； 使用SSC溶液（ 5mol/L NaCl、0.015mol/L柠檬酸钠）抑制DNase降解DNA;4. 苯酚抽提法 原理：苯酚作为蛋白变性剂，同时可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚处理细胞匀浆液， 蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，离心分层取水相，多次重复，合并水相， 用乙醇沉淀，即得到DNA。 ;在强碱环境中，大分子量的核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将pH调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形成不溶性网状结构，但质粒DNA仍然呈可溶状态。 ;二 RNA提取的基本原理与方法;1）所有玻璃器皿应置于180℃烘箱烘烤4小时以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制品需用01%的DEPC（二乙基焦碳酸盐）溶液处理，然后121 ℃高压消毒40分钟； 2) 全部过程需戴手套、口罩操作，并经常更换手套； 3) RNA电泳漕需用去污剂洗涤，用水冲洗干净后，用乙醇干燥，浸泡于3%的H2O2水溶液中，室温10分钟后，再用0.1%DEPC水彻底冲洗。;1）细胞的有效破碎，尤其是植物细胞带有细胞壁，研磨要彻底； 2) 使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中； 变性剂有异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠等； 3) 有效地抑制内源及外源RNase活性； 4) 将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开。策略一是先提总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；策略二是直接在酸性条件下用酚-氯仿抽提，低pH的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA留在有机相中，水相中的RNA可用异丙醇沉淀出来。;2. 总RNA提取的方法;（二）mRNA的提取;二 DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定;（二）琼脂糖凝胶电泳鉴定;第二节 凝胶电泳;凝胶的分辨能力与凝胶的类型和浓度有关。;（二）凝胶电泳的影响因素;4、 电场强度。 　 电压一般不超过5v/cm ，电压高，电泳快，但分辨率低。电压低，电泳慢，但分辨率高。;二 琼脂糖变性胶电泳;三 聚丙烯酰胺凝胶电泳;　 聚丙烯酰胺凝胶制备在玻璃板上或玻璃管中。 电泳漕分上漕和下漕，各装有电极，通过凝胶使它们连成导电的整体。 电泳中带有电荷的分子在电场作用下移动，移动速度依赖于电场强度、分子净电荷以及分子的大小和形状，同时也与介质的离子强度、黏度和温度有关。;四 脉冲场凝胶电泳;;五 凝胶电泳中DNA的检测;第三节 核酸和蛋白质的分子杂交;（一）探针的制备;（2）随机引物法;2. 末端标记;（二）标记物及其检测;二 Southern杂交;三 Northern杂交;四 菌落或噬菌斑杂交;五 Western杂交;第四节 聚合酶链式反应技术;高温变性: 92-96℃ 低温退火: 37-72℃ 适温延伸: 72℃ ;5’ 3’;（二） 平台期与平台效应; PCR产物的积累规律示意图;二 PCR反应体系;（一）TaqDNA聚合酶;（二）引物;（三）PCR反应的最佳条件;三 PCR技术的应用;（二） 锚定PCR;（三） 反向PCR;（四） 巢式PCR;（五） 实时定量PCR;（1）TaqMan荧光探针;（2）SYBR荧光探针;第五节 DNA序列分析;第六节 基因定点诱变;二 寡核苷酸引物诱变;三 PCR诱变;大引物诱变法示意图;第七节 DNA与蛋白质互作分析;1. 酵母双杂交系统的原理; 酵母单杂交系统的原理示意图;二 凝胶阻滞试验;三 DNaseI足迹试验;三 DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析;（二） 染色质免疫沉淀技术