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楮实子多糖提取工艺的研究进展 摘要：目的 优化楮实子多糖提取工艺，考察其抗皮肤光老化能力。方法 以多糖得率为指标，采用水提醇沉法提取楮实子多糖，在单因素基础上利用L 皮肤光老化主要机制为中波紫外线（UVB）穿透皮肤表皮层，导致皮肤内活性氧（ROS）的过量产生楮实子化学成分主要包括生物碱、氨基酸、多糖等1 实验部分1.1 药品与试剂人皮肤成纤维细胞（ESF-1，北京协和细胞资源中心）；楮实子（批号：191003购自佳木斯市百盛药材公司，经黑龙江中医药大学陈效忠教授鉴定为桑科植物构树Broussoneria papyrifera(L.)Vent.的干燥成熟果实）；D-无水葡萄糖对照品（批号：110833-201205，中国食品药品检定研究院）；DMEM培养液、胰蛋白酶、PBS,Gibco公司；胎牛血清、二甲基亚砜、MTT,Sigma公司。1.2 主要仪器YT-SY96型酶标仪（上海热电仪器有限公司）；8-5K型离心机（上海安亭科学仪器厂）；FZ-A型紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂）；IX-71-21PH型Olympus倒置显微镜（日本Olympus公司）；MS-500E型半自动生化分析仪（四川美生公司）。1.3 楮实子多糖提取工艺1.3.1 楮实子多糖的提取楮实子干燥后粉碎，称取50g，加入750mL蒸馏水，浸泡120min，置于水浴锅中升温至80℃，趁热过滤，滤液浓缩至50mL，待冷却后按照醇沉比1∶4加入无水乙醇，放置过夜，离心，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，即得楮实子粗多糖。1.3.2 楮实子多糖含量测定准确称取葡萄糖对照品0.15g，定容至100mL容量瓶中，制成浓度为1.5mg·mL1.3.3 单因素试验优化楮实子多糖提取工艺(1）提取温度与楮实子多糖含量的关系按照“1.3.1”项下的方法提取多糖、“1.3.2”项下的方法测定多糖含量，其他条件不变，比较在40、60、80、100℃的多糖含量，每个试验重复3次。(2）提取次数与楮实子多糖含量的关系按照“1.3.1”项下的方法提取多糖、“1.3.2”项下的方法测定多糖含量，其他条件不变，比较提取1、2、3、4次的多糖含量，提取次数两次或超过两次的提取液需合并滤液后再浓缩至50mL，每个试验重复3次。(3）料液比与楮实子多糖含量的关系按照“1.3.1”项下的方法提取多糖、“1.3.2”项下的方法测定多糖含量，其他条件不变，比较料液比为1号（1∶10）、2号（1∶15）、3号（1∶20）、4号（1∶25）、5号（1∶30）对楮实子多糖含量的影响，每个试验重复3次。1.3.4 楮实子多糖提取工艺优化的正交试验根据单因素试验结果，试验以提取温度、提取次数和料液比例为考察因素，设置每个因素3个水平，采用四因素三水平正交试验表（L1.3.5 多糖提取工艺的验证试验按照正交试验筛选的最佳试验条件，重复进行3次试验，测定楮实子多糖含量，评价优化后工艺的合理性。1.4 楮实子多糖抗皮肤光老化能力1.4.1 光老化模型建立将处于对数生长期的ESF-1用0.25%胰酶消化后接种于96孔板，培养24h。待细胞全部贴壁后移除培养液，每孔加入100μL PBS缓冲液，置于强度为70mJ·cm1.4.2 试验分组将处于对数生长期的ESF-1接种于96孔板，分为空白组、模型组、维生素E组（阳性组）、给药组，各组均设5个复孔。空白组给予DMEM培养48h，模型组、维生素E组、给药组于70mJ·cm1.4.3 指标测定取各组细胞上清液，按照SOD、MDA、GSH-PX试剂盒说明书进行操作，分别测定其指标变化，以考察楮实子多糖抗UVB所致细胞氧化损伤。1.4.4 数据处理采用SPSS 21.0统计软件进行分析。两组间比较用独立样本t检验，P0.05说明差异有显著性意义。2 结果与讨论2.1 单因素试验结果2.1.1 提取温度的影响图1为提取温度与楮实子多糖含量的关系图。由图1可见，随着提取温度的升高，楮实子多糖含量亦随之增高，表明升高温度有利于楮实子多糖的提取，然而当温度升至80℃后含量曲线接近与横轴平行，表明随温度升高楮实子多糖含量无明显变化，因此，选择优化温度范围为70～90℃。2.1.2 提取次数的影响图2为提取次数与楮实子多糖含量关系图。由图2可见，随提取次数增加，多糖含量先大幅度增加后小幅度下降，原因为提取次数增加，提取液的量增加，浓缩时间延长，使少量植物多糖降解。当提取次数为2次时，楮实子多糖含量最高，因此，选择优化提取次数为1～3次。2.1.3 料液比的影响图3为料液比与楮实子多糖含量的关系图。由图3可见，料液比对多糖含量的