临床样本的采集运输和保存及核酸提取资料.pptVIP

2021/1/12 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 正常时，28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否那么提示RNA的降解 RNA完好性鉴定： 2021/1/12 5、核酸的贮存——DNA保存 1〕短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE〔tris和EDTA〕缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反响，PH低于7.0时DNA容易变性。 2〕长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 2021/1/12 核酸的贮存——RNA保存： 的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70℃保存。 RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20 ℃保存。 RNA假如以DEPC〔焦碳酸二乙酯〕可以抑制RNA酶对RNA的降解 2021/1/12 三、基因组DNA的别离与纯化 2021/1/12 〔一〕、DNA样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新颖组织，假设不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮 2021/1/12 DNA提取前样本采集、预处理和保存： 全血 抗凝剂： EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素 抗凝剂处理血 肝素 柠檬酸* EDTA* -80℃ 保存2个月，第10天收率90% 4 ℃ 第四天收率90% 第10天提取效果差 第十天收率85% 室温 提取效果差 第四天收率90% 第十天提取效果差 2021/1/12 〔二〕、DNA提取 〔一〕酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进展沉淀。获DNA大小为100－150kb。 2021/1/12 酚 抽 提 法 提 取 步 骤： 2021/1/12 DNA酚抽提法示意图 2021/1/12 主要试剂的作用： EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性 2021/1/12 SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性 2021/1/12 蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用 2021/1/12 苯酚： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA 2021/1/12 DNA的沉淀： 1〕无水乙醇沉淀 沉淀前往往参加NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子外表的负电荷，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 2〕异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子 2021/1/12 〔二〕 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚屡次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。 2021/1/12 〔三〕磁珠法： 磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH值下与核酸别离，再通过挪动磁珠来获取DNA 2021/1/12 〔四〕微柱法 ： 利用DNA在高盐、低pH的特定溶液环境下可吸附在固相介质〔如硅胶膜〕上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中 2021/1/12 〔三〕、DNA的浓缩 固体聚乙二醇〔PEG〕浓缩：用透析袋 外敷PEG至适宜量 丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积 2021/1/12 〔四〕、DNA回收 主要是从电泳中别离回收DNA片段 回收原那么：尽量进步回收率 去除回收DNA样品中的污染物 2021/1/12 DNA降解的原因 样本不够新颖，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？