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医学免疫学实验指导：变态反应（Allergy） 【内容】 实验 、动物过敏试验 实验 、肥大细胞脱颗粒试验 变态反应，又称超敏反应（Hypersensitivity），是免疫机体再次接触相同变应原时发生的反应过度剧烈而导致生理功能紊乱或组织损伤的病理性免疫反应。是临床上的常见病及多发病，发病率为10%~20%。检测变态反应的实验方法有多种，下面主要介绍动物过敏试验及肥大细胞脱颗粒试验。 试验 、动物过敏试验 （allergization test of guineapig） 豚鼠过敏试验属Ⅰ型变态反应，与人类的青霉素和异种血清蛋白引起的过敏性休克相似，通过了解动物实验性过敏性休克的方法及结果观察，有助于加深和理解Ⅰ型超敏反应的主要特点，发病机制及临床表现。其基本原理是先给豚鼠注射异种蛋白，经过一段时间，动物产生IgE等亲细胞型抗体，吸附于体内组织中的肥大细胞及血液中的嗜硷性粒细胞，使机体对该变应原（异种蛋白）处于致敏状态。当第二次给处于致敏状态的动物注射相同变应原时，变应原与肥大细胞和嗜硷性粒细胞表面的IgE结合，引起肥大细胞和嗜硷性粒细胞膜构型改变，细胞脱颗粒，释放多种活性介质，作用于相应效应器官，引起各种过敏症及过敏性休克。 【材料】 1、动物：体重150克左右的幼小豚鼠3只。 2、变应原：人血清、鸡蛋白。 3、注射器、针头、酒精棉球 【方法】 1、致敏注射：取健康豚鼠3只，分别编为1号、2号、3号。 ①于1号豚鼠腹腔注射1:10卵白蛋白1ml。 ②2号豚鼠腹腔注射1:8人血清1ml。 ③3号豚鼠不注射。 2、发敏注射：经14~21天致敏后，3只豚鼠分别同时心内注射1:10稀释卵白蛋白1-2ml，观察各豚鼠行为表现有何差异。 【结果】 1、1号豚鼠很快出现烦燥不安，耸毛、抓鼻、打喷嚏、痉挛性跳跃、大小便失禁等症状，重者数分钟内由于呼吸肌痉挛窒息而死亡。 2、2号和3号豚鼠无任何症状发生。 试验 、肥大细胞脱颗粒试验 （degranulation test of mastocyte） 肥大细胞脱颗粒试验是一种体外测定速发型变态反应的方法。本试验既可用已知抗原检测病人是否存在有相应的IgE，也可用过敏反应的病人血清寻找相应的过敏原和选择用药。其实验结果与皮肤反应及临床过程相一致。其基本原理是肥大细胞受到IgE、促分泌剂（如过敏毒素、C3a、C5a、P物质）或低氧、冷热、阳光等刺激以后，均能引起脱颗粒。亲细胞抗体IgE可通过Fc受体吸附于肥大细胞表面，当与相应抗原结合后，使IgE的Fc段变构，促使肥大细胞膜改变，导致细胞内发生一系列变化，使肥大细胞内嗜硷性颗粒脱出，并释放活性介质作用于效应器官，引起一系列临床症状。 【材料】 1、大白鼠血清的制备　取体重200g左右的健康雄性大白鼠一只，麻醉后心脏采血，分离血清备用。 2、大白鼠肥大细胞的制备　取上述大白鼠腹腔注射pH7.2的Hanks液15~20ml（含EDTA，浓度0.5mg/ml）。轻揉腹部1分钟后，于腹部作一小切口，用毛细吸管吸出腹腔液，离心3000rpm15分钟。弃上清，管底细胞用含有上述大白鼠血清的营养液洗涤一次（6ml Hanks液加2ml大白鼠自身血清），弃上清，将管底细胞悬浮于1ml含有大白鼠自身血清的Hanks液中备用（细胞应置于冰浴中）。 3、肥大细胞的鉴定　取细胞悬液1滴加于载玻片上，并盖上涂有中性红的盖片，在高倍镜下观察100个细胞。正常肥大细胞为正圆形、边缘光滑，细胞浆内含有分布均匀的颗粒。如果细胞肿胀，细胞边缘不整齐，颗粒自细胞内流出，说明该细胞自身脱颗粒。若超过30%者，不宜用于正式试验。 [方法] 1、取上述肥大细胞悬液1滴置于载玻片上，加被检病人血清1滴，混匀后放37℃静置5分钟，使血清中IgE吸附于肥大细胞表面。 2、取出玻片，加相应抗原1滴，混匀，置37℃5~10分钟。 3、取出载玻片，盖上涂有中性红染液的盖片，高倍镜观察。 4、对照试验 （1）抗原对照：细胞悬液1滴加抗原1滴混匀。 （2）血清对照：细胞悬液1滴加病人血清1滴混匀。 将上述两种对照置37℃5~10分钟，同正式试验一样，盖上涂有中性红染液的盖片，显微镜检查，通常应没有脱颗粒现象。 【结果】 1、脱颗粒细胞：细胞肿胀，边缘不整齐或破裂细胞内有空泡。 2、随机计数100个肥大细胞，并计数脱颗粒细胞数。按下列公式计算脱颗粒百分比： 　脱颗粒肥大细胞(%) = 脱颗粒肥大细胞数 ×100% 脱颗粒肥大细胞数+正常肥大细胞数 结果大于30%者为肥大细胞脱颗粒试验阳性。 【思考题】 1.试用Ⅰ型变态反应发生的机理解释试验结果。 2.简述肥大细胞脱颗粒试验的 原理及应用。