第四讲基因工程.pptxVIP

第四章 基因工程;一、基因工程定义; 2.基因工程核心技术： DNA克隆技术（又称为DNA重组技术、分子克隆技术） 具体过程：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体）。;基因克隆的技术路线 基因 载体 ;基因克隆示意图 ;3.基因工程要件 工具酶 （限制性内切酶、连接酶、聚合酶等） 目的基因（外源基因） 载体 （质粒、噬菌体DNA等） 受体细胞 （大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等）;基因工程、 遗传工程??? 基因操作、 重组DNA技术、 基因克隆、 分子克隆;重组DNA技术进展;1993 基因工程西红柿在美国上市 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程。 其中基因工程是核心。;胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体 ;4.基因工程与医学的关系;（4）基因治疗 gene therapy —就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗 的目的。 基因置换 基因修正 基因修饰 产物补偿缺陷细胞 基因失活 反义技术封闭基因,抑制有害基因 对象 体细胞 生殖细胞 ; 1990.9.14 首例基因治疗 4岁 女孩 严重免疫缺陷症(SCID) 缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2--脱氧腺苷含量升高 毒性 严重破坏免疫功能 治疗： ADA基因 LN逆转录病毒载体 靶细胞为病人淋巴细胞 回输 ;杰辛格事件 1999年公布：18岁的亚利桑那州高中毕业生泽西·杰辛格因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC）部分缺陷症在宾夕法尼亚大学接受基因治疗。该校基因治疗研究所的研究者采用导管经腹股沟动脉直及肝血管，将携带校正基因的重组腺病毒导入肝脏，外源基因的表达可望校正OTC缺陷所导致的高血氨症。基因治疗4天后，杰辛格出现发烧、凝血而死亡。;二、基因工程常用工具酶;常用的工具酶：;一把特殊的剪刀——限制性内切酶的发现 阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖;1.作用： 识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 2.命名： EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) (Escherichia coli 大肠杆菌） 3.分类：Ⅰ型:识别特定位点，随意切割。 Ⅱ型：识别特定位点，并在位点内切割 （应用最广泛） Ⅲ型:识别特定位点，附近切割。 ;核酸的结构;4.识别和切割位点特点 回文结构 4～8 bp 产生两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 ;粘性末端与平头末端;续表;续表;DNA酶切消化与电泳分析;同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端 BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就 是一组同尾酶,它们切割DNA分子后都形 成GATC四个核苷酸形成的粘性末端。 ;同尾酶;DNA上的酶切位点;;5、影响限制性核酸内切酶消化的因素;（二）DNA连接酶;DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酰转移酶 ;1。DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性;2。Taq DNA聚合酶： 耐高温，具有聚合及3′→ 5′外切酶活性。常用于PCR扩增。 ;三、基因工程载体;（二）理想克隆载体的条件;（三）种类：;1.质粒载体; 人工质粒载体 严紧型质粒载体 松弛型质粒载体 ;例 1 pBR322;特点： 分子小，松弛型 含常用酶切单切点 有Ampr和Tcr抗性基因作为筛选标记 ;;;2、λ噬菌体载体;λ噬菌体(λphage) 基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区 DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb 常用：EMBL 系列、 λgt 系列、charon系列 科斯质粒