细胞复苏步骤和注意事项.pdfVIP

细胞复苏步骤注意事项： 【材料】 1. 常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。 2. 培养液（ DMEM ）胎牛血清（ CBS ）二甲基亚砜（ DMSO ） 【操作程序】 1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射 40min 以上。 2. 培养液（ DMEM ）、0.25 ％胰蛋白酶（ Trypsin ）恒温水浴箱 370C 预热 20min ，备用。 3. 二甲基亚砜（ DMSO) 在 40C 冰箱中冷藏 30min ，备用。 4. 从液氮保存罐中取出冻存管， 立即放入 400C 水浴中， 快速摇晃， 直至冻存液完全融化。 5. 将细胞悬液移入 15ml 离心管，缓慢加入 4ml 培养液，离心（ 1000r/min ，5min ）。 6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。 7. 记录复苏日期。 【注意事项】 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套， 护目镜。 此项尤为重要， 细胞冻存管可能漏入液氮， 解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（ DMSO ）对 细胞不是完全无毒副作用， 在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在 1-2min 内使冻存液完全融化 。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（ DMSO ）最好 选择进口产品。 3. 离心前须加入少量培养液 。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀 释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养 瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO ，去除死细胞，这个是 标准流程， 但对一般人来说，把握不好离心转速和时间， 转的不够活细胞沉底的少，细胞就 全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。 另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（ DMSO ），DMSO 对细胞有一定的毒副作用，所 以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行 复苏，结果无有异常。 5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时 1ml 细胞液要加 10ml －15m 培养液， 而在我的试验中的经验总结为 培养基越少细胞越容易贴附 。 6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏 1 管细胞一般可分装到 1-2 只培养瓶 中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。 7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是 DMSO 的浓度，从 如果你加培养基的太少， 那么 DMSO 的浓度就会比较大， 就会影响 细胞生长，从以前的资 料来看， DMSO 的浓度在小于 0.5% 的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是 1％。 所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO 的话那么加 10ml 以上的培养基就恰好稀释到了 无害浓度。 一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时， 细胞内和外环境中的水都会形成冰晶， 能导致细胞内发生机 械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、 PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养 液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。 贮存 在－ 130 ℃以下的