电泳常见问题解答.pdfVIP

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在 SDS－PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris － HCL 缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7，分离胶 pH8.9；而电泳缓冲液使用 的 Tris －甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH 环境呈弱酸性，因此 甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 CL 离子却很 高，两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度， 压着蛋白质分子聚集到一起， 浓缩为一狭窄的区带。 当样品进入分离 胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增 加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作 用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以， pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排 除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处 理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。 1）还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT （或Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白 相结合的分子，在电泳中， 只根据分子量来分离。一般电泳均按这种 方式处理，样品稀释适当浓度， 加入上样 Buffer ，离心，沸水煮 5min ， 再离心加样。 2 ）带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用 可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸 胺可捕集过量的 DTT ，而防止银染时的纹理现象。 100ul 样品缓冲液 中 10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温 30min 。 3 ）非还原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只 用 1％SDS 沸水中煮 3min ，未加还原剂， 因而蛋白折叠未被破坏， 不 可作为测定分子量来使用。 3. SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用： 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体， 其凝 固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7，分离胶选择 pH8.9，选择 tris －HCL 系统， TEMED 与 AP ：AP 提供自由基， TEMED 是催化剂， 催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（ SDS）：阳离子 去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高 SDS电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待 凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS 结晶。一般 凝胶可在室温下保存 4 天， SDS 可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染 料又各自不同的染色方法， 具体可参照郭尧君编著的 《蛋白质