重组导入受体细胞 (2).pptVIP

7. 花粉管通道法 （1）原理：在花粉管通道形成之后封闭之前一段时间，使外源DNA能沿着花粉管通道进入胚囊，转化尚不具正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞，从而实现基因的转移。 （2）适用范围：植物 第六十二页，共88页。 7. 花粉管通道法 （3）特点： 直接得到转化种子，不经过组培，减少了基因型的影响； 操作简单经济，无需昂贵仪器和化学药品，可直接在大田操作； 大量快捷，性状稳定，转化率高；可获得1×10-2~1×10-1的高遗传转化率。 不仅可以导入供体的总DNA，而且可导入含目的基因的质粒，甚至可将化学诱变剂导入胚囊。 缺点：工作时间受自然花期限制，田间操作受环境影响大，基因组以随机方式结合，要求工作人员经济性要强，工作效率较低。 第六十三页，共88页。 我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in En-zymology”报道的研究成果。 现该技术主要在蔬菜育种上应用。（白菜、茄子、黄瓜、番茄、辣椒等 操作步骤 1.外源DNA的制备 2. 分析受体植物的受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间方法（3种） 柱头涂抹法 柱头切除法 花粉粒吸入法 3.后代材料处理 第六十四页，共88页。 9. 激光微束穿孔转化法 早在1984年Tao等首先利用激光微束对动物细胞进行DNA转化试验、此庸Web等利用激光微束技术对原生质体、花粉以及活细胞内的叶绿体进行外源DNA导入获得成功，并用荧光标记的大肠杆菌pBR322质粒DNA在转化细胞中得到检测。 （1）原理： 利用直径很小、能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。在荧光显微镜下找适合的细胞，然后用激光代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔外于细胞周围的外源DNA分子随之进入受体细胞。 第六十五页，共88页。 9. 激光微束穿孔转化法 （2）特点：操作简便快捷，转化效率高10-3-10-4，无宿主限制，但需要贵重仪器，技术条件要求高，稳定性和安全性不如电穿孔法和基因枪法。 （3）适用范围：动植物细胞、组织、器官及线粒体、叶绿体。 第六十六页，共88页。 基因枪介导的DNA转移 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford(1987)最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。 第三十页，共88页。 一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹； 第二类是以高压气体(high pressure gas)作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。其工作原理是把载有DNA的钨(金)粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴着微水滴。在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。当载片受阻于金属筛网时,载有DNA的钨(金)粒继续向下冲击射入细胞。 第三十一页，共88页。 第三十二页，共88页。 第三十三页，共88页。 第三类是以高压放电为驱动力。其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨(金)粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。这一点非常重要，因为不同的外植体需要不同的参数。采用该放电轰击、已在大豆和水稻上成功地获得了转基因植株(Christou等，1992) 第三十四页，共88页。 第三十五页，共88页。 第三十六页，共88页。 第三十七页，共88页。 第三十八页，共88页。 DNA微粒载体的制备原理是CaCl2对DNA沉淀作用，亚精胺、聚乙二醇具有粘附作用、将这些化合物与DNA混合后与钨粉或金粉混合，吹干后，则DNA沉淀在载体颗粒上 第三十九页，共88页。 步骤 (1)DNA微弹的制备 1)微粒体的洗涤 ①取60-100mg钨粉或金粉，其微粒直径最好选择为细胞直径的1/10，并溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。微粒体处理后可在密闭条件下，室温贮存1周。 ②离心尽量除去乙醇。加1ml无菌水振荡离心，移去上清液，如此重复2次，将残留的乙醇除净，再用1ml无菌水重悬沉淀，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过1周。 第四十页，共88页。 2)DNA—微粒载体的制备 ①上述微粒贮存液离心．移去上清液，加1ml无菌水重悬； ②每份样品取25μl微粒重悬液，加入25 μl DNA(1 μg/ μl)，手指振荡3次，充分混匀； ③ 加入25μl2.5mol/LCaCl2溶液，手指振荡5次； ④加入20μl40％PEG 4000，手指振荡5次； ⑤加入2.5ml0.1mol/L亚精胺，手指振荡5次； ⑥混合液在室温静置10min，使DNA沉淀到微粒体上； ⑦离心5min，移去50-60μl上清液(严格掌握