重组蛋白的分离纯化.pptVIP

第五十八页，共104页。 2 融合基因在大肠杆菌中的诱导表达 pET-28c-cycD 提取质粒，转入BL21表达宿主 30μg/ml Kan, LB 37 ℃过夜培养，之后按1：100转接 OD600 =0.6 IPTG=0.1mmol/L 诱导表达，每隔1小时取样，确定最佳时间为4小时 第五十九页，共104页。 pET-28c-cycD转化的菌株经IPTG诱导后在分子量约43 000处出现一条蛋白条带。 灰度扫描分析表明目的基因在IPTG诱导4h后表达量最大，约占菌体总蛋白的23％。 分别对表达菌体的裂解上清和沉淀进行12％ SDS分析，发现目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，说明表达的CyclinD1蛋白以包涵体形式存在。 第六十页，共104页。 3 包涵体的洗涤与变性 大量诱导表达后，离心收集菌体 0.1倍培养物体积的溶液A悬浮 超声裂菌 4 000 g于4 ℃ 离心15 min，回收的沉淀即为粗制包涵体 0.5％ Triton X-100和2 mol／L尿素的 磷酸缓冲液依次洗涤 悬于溶液B 搅拌溶解1 h 12 500 g，30 min离心，收集上清 第六十一页，共104页。 溶液A：20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，0.1 mmol/L PMSF，1 mmol/L巯基乙醇，pH=7.4 磷酸缓冲液: 20 mmol/L磷酸钠,500 mmol/L NaCl，pH=7.4 溶液B:8 mol/L尿素，20 mmol/L磷酸钠500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，0.1 mmol/L PMSF，1 mmol/L巯基乙醇，pH=7.4 第六十二页，共104页。 重组菌制备包涵体经洗涤后，用8 mol/L尿素变性，加到HisTrap HP Ni 螫合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。 洗脱蛋白经12％的SDS—PAGE分析表明，纯化的表达产物在分子量43 0o0处显示出一条蛋白带，凝胶薄层扫描分析纯度达98％ 以上。 第六十三页，共104页。 4 目的蛋白的亲和层析纯化和复性 变性上清 微孔滤膜过滤 预先用溶液B平衡过HisTrap HP柱 l0倍柱体积的缓冲液B l0倍柱体积的缓冲液C洗柱 5倍柱体积缓冲液D特异性洗脱，分步收集，每管约1 mL 第六十四页，共104页。 缓冲液C： 缓冲液B中含20 mmol/L咪唑 缓冲液D: 缓冲液B中含500 mmol/L咪唑 第六十五页，共104页。 收集液进行12％的SDS检测 合并含有目的蛋白的各管样品，适当稀释，装入透析袋复性 含6 mol／L尿素的磷酸缓冲液4 ℃透析过夜 分别用4 mol/L,3 mol/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L的梯度透析各4 h以上 PBS缓冲液透析过夜 蛋白溶液在44 ℃下12 500 g离心20 min 上清即为可溶性复性蛋白，冻干后备用 第六十六页，共104页。 纯化的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的分段透析复性方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，获得复性的重组CyclinD1蛋白的纯度达-98％ 以上． 第六十七页，共104页。 Western blot检测表达产物 BL21(DE3)菌裂解液, 诱导4 h的转化菌裂解液,纯化的融合蛋白 SDS电转移至硝酸纤维素(NC)膜上 封闭 抗CyclinD1单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG进行孵育 二氨基联苯二胺(DAB)显色 第六十八页，共104页。 第六十九页，共104页。 融合表达蛋白的分离纯化 与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。 目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。 金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag 等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。 第七十页，共104页。 第七十一页，共104页。 第七十二页，共104页。 表达融合蛋白的优点 (1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。 (2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。 (3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。 (4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。 (5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。 第七十三页，共104页。 rhALR的纯化 菌液上清经低盐透析后，超过DEAE-Sepharose FF柱的饱和吸附量上样，洗脱组分脱盐后再上D