发酵工艺综合实习指导书-内容.docx

目 录 综合实验一 综合实验二 综合实验三 土壤中稀有放线菌的别离和纯化 及抗生菌的体外抗菌鉴定 玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵 甜酒的酿造 第 1 页 共 27 页 综合实验一 土壤中稀有放线菌的别离和纯化 及抗生菌的体外抗菌鉴定 一 土壤中稀有放线菌的别离和纯化 1 实验目的 了解采集土样的要求和方法，掌握由土壤中别离稀有放线菌的根本原理和操作技术，学 习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 2 实验原理 筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。 迄今为止， 已发现的抗生素有 80%皆来自于放线 菌。 放线菌主要存在于土壤中， 并在土壤中占有相当大的比例。 一般地， 放线菌在比拟枯燥、 偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同， 放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。 土壤是微生物的大本营， 其中的放线菌多以链霉菌为主， 的其它放线菌统称为稀有放线菌。 假设以常规方法进行别离， 因此人们通常将除链霉菌以外 得到的几乎全部是链霉菌。 然 而， 当采用加热处理土样、 选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时， 均可提高稀有放线 菌的获得率。 由土壤中别离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、 混土法和喷土法等， 本实 验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。 3 仪器和材料 〔 1〕培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏 1号琼脂，以上每种培养基皆用 500ml三角瓶分装 250ml 。 〔 2〕灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿， 1ml 、5ml 吸管， 250ml 三角瓶分装 90ml无菌水〔含 30粒玻璃珠〕 ， 18× 180mm试管分装 9ml无菌水， 牙签， 玻璃刮铲， 18× 180mm试管中分装 10 ml 1‰K2Cr2O7母液。 〔 3〕其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。 4 试验步骤 〔 1〕采土：选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取 5～ 10cm深处的土壤约 150g 左 右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。 第 2 页 共 27 页 〔 2〕土样预处理：新鲜土样应适当风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发 育的影响。 〔 3〕制备平板：每组取 10套无菌培养皿，将冷却至 50℃左右的各培养基，分别倒入平 皿， 每皿约 15～ 20ml 。每种培养基中需参加 20ppm的K2Cr2O7溶液。 在皿盖上注明培养基种类 及组号。 〔 4〕 制备土壤稀释液： 每组称取 10g土样， 放入 90ml无菌水中， 得到土壤原液。 手摇 15～ 20min后，静置 1min。再用无菌吸管取 1ml 上清液，置于 9ml 无菌水中，充分混匀，那么得到 10－2稀释液。 依此类推， 制备 10－3 、10－4稀释液 〔一般地， 较肥的土壤使用 10－3～ 10－5稀释液， 而瘦土那么使用 10 －2～ 10－4稀释液〕。 〔 5〕铺平板：用 1ml无菌吸管分别取 0.1ml 10 －3～ 10－5稀释液，置于培养基平板中央。 然后， 再用无菌的玻璃刮铲均匀涂布，静置 10min 。每1稀释度 3个重复， 每1种培养基 10套平 板。并注明各稀释度。 〔 6〕培养及观察：将各平板置于 28℃恒温箱中倒置培养 14天。要求分别在第 2天、 7天 和14天进行观察， 并根据菌落大小、 气生菌丝有无、 气生菌丝和基质菌丝的颜色及可溶性色 素有无等培养特征， 选择单菌落放线菌进行纯培养， 〔 7〕纯培养：及时将选定的单菌落接入高氏 时，中间可加 1次划线别离培养，然后再转斜面。 5 结果与讨论 将实验结果填入下表。 同时在平板反面的相应位置上作好标记。 1号琼脂斜面，每个菌株接 1支斜面。必要 思考题 1、在别离土壤放线菌时为什么要选用多种培养基？ 2、在培养基中添加 K2Cr2O7有何作用？ 第 3 页 共 27 页 二 抗生菌的体外鉴别 1 实验目的 了解抗生素产生菌体外筛选法的原理，学习并掌握抗生菌的鉴别方法。 2 实验原理 由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。