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人民医院免疫组织化学 一、免疫组织化学技术 免疫组织化学（简称：免疫组化）技术是近些年发展起来的一门新技术。它是在抗原抗体特异性反应存在的前提条件下，用免疫学的方法进行组织化学检测。即借助于被标记一种可见物质（酶、荧光素或金属）的手段，检测另一种物质（抗原/抗体，主要是用标记抗体来查找抗原）在组织细胞内存在的部位。标记物与组织内特异性抗原或抗体反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察、分析。近20年来，随着新方法的日新月异，标记物层出不穷，免疫组化技术在国内外得到了广泛的普及，应用范围逐渐扩大，技术环节也日趋成熟、简练，用于临床病理，对病理学的发展起到了极大的推动作用。成为当今形态学研究领域中不可或缺的手段。同时也能为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、鉴别诊断、预后的估测等提供重要依据，已成为临床病理诊断中常规检查方法之一。??? 免疫组化注意事项： 1. 组织标本的良好固定是免疫组化获得理想的染色效果和正确判断结果的重要环节。因为如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论采取何种染色都是徒劳的。在这方面，应统一组织固定程序。首先，固定液的配制要统一，要求使用“中性福尔马林“。标本及时固定，固定时间亦要充分，但一般不超过24小时。大标本要注意得到及时和充足固定液的浸透固定，必要时测量后切开固定，或取成小块合适的病变组织后再固定。这对普通病理形态结构的显示可能也有好处，更是建立具有可重复性的标准的免疫组化程序至关重要的一步。 2. 切片时需注意的问题 （见本细则第三章）。 3. 载玻片的处理: 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用APES或PoLy-L-Lysine等几种试剂，对己清洗的载玻片进行处理。 4. 常用酶消化: 胰蛋白酶: 一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37℃、10～40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 胃蛋白酶: 一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180? 分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如: Laminin（层粘蛋白），CollagenⅣ(Ⅳ型胶原)等。 5. 抗原修复: 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复（以高压锅修复效果最佳）。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01mol?枸橼酸盐缓冲液 (PH6.0 )和lmMEDTA抗原修复液 (PH8.0)效果最好。 高压锅抗原修复操作方法: 切片脱蜡至水。将1500m1～3000m1的抗原修复液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀，当压力锅开始慢慢喷气时 (约加热5～6分钟后)，计时1～2分钟，然后将压力锅端开，远离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3次，下接免疫组化染色步骤。 微波炉抗原修复操作方法: 切片脱蜡至水后，将切片放入盛有抗原修复液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 92℃～98℃之间并持续 10～15分钟 （注意:无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却20~30分钟 (注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 电炉煮沸抗原修复操作方法: 切片脱蜡至水后，放入盛有抗原修复液 (工作液)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸， 从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15～20分钟，然后端离电炉，室温冷却20～30分钟，蒸馏水冲洗，PBS 洗，下接兔疫组化染色步骤。 二、常用免疫组化染色方法（六种） SP法免疫组化染色 1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。 2. 基本染色方法： （1）石蜡切片脱蜡至水。 （2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。 （4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵